Mutagénèse et sélection de catalyseurs enzymatiques pour des applications biotechnologiques : développement d’une méthode intégrée in vivo
La biocatalyse, c’est-à-dire l’utilisation d’enzymes en chimie de synthèse, offre un large éventail de solutions « vertes » pour de nombreuses conversions. Les avantages des catalyseurs enzymatiques sont multiples : les enzymes élargissent les possibilités de synthèse à des transformations non accessibles par les procédés de chimie conventionnelle, la catalyse est le plus souvent asymétrique et réalisée dans des conditions douces réduisant risques, coûts et pollutions. Pour atteindre le plein potentiel de la biocatalyse, il est nécessaire de diversifier la spécificité de substrat des enzymes natives et améliorer leur vitesse de réaction sur des composés non-naturels. Des approches complémentaires sont activement développées, allant de la recherche de nouveaux catalyseurs dans la biodiversité accessible dans les banques de données génomiques aux méthodes de mutagénèse aléatoires ou dirigées et de détection à haut débit des activités enzymatiques. Lorsque l’activité enzymatique confère un avantage de croissance aux cellules-hôtes, la sélection in vivo dans un contexte génétique approprié permet de cribler de très larges banques de variantes des enzymes cibles.
A l’interface entre génétique moléculaire et biocatalyse pour la synthèse de composés chimiques d’intérêt, l’objectif du projet de thèse est d’installer dans le chromosome de l’organisme modèle Escherichia coli un système de mutagénèse in vivo faisant appel à des éditeurs de bases couplés à la RNA polymérase du phage T7 dont l’activité sera dirigée sur le gène d’intérêt choisi. Une fois validée, la méthode sera appliquée à l’évolution d’enzymes de type déshydrogénase, déjà activement étudiées dans le laboratoire, pour la sélection de variantes efficaces pour des conversions chimiques d’intérêt industriel.
Le/la doctorant.e pourra acquérir une expertise en génétique moléculaire, biologie synthétique, évolution dirigée in vivo et en biocatalyse appliquée à la synthèse organique et bénéficiera de l’environnement multidisciplinaire de l’UMR Génomique Métabolique.
Elucidation de la voie de dégradation de l’homarine dans les océans
Contexte :
La production biologique primaire dans les océans exerce un contrôle important sur le CO2 atmosphérique. Le phytoplancton transforme chaque jour 100 millions de tonnes de CO2 en des milliers de composés organiques différents (1). La majeure partie de ces molécules(sous forme de métabolites) est biologiquement labile et retransformée en CO2 en l'espace de quelques heures ou de quelques jours. Les boucles de rétroaction climat-carbone médiées par ce réservoir de carbone organique dissous (COD) labile dépendent de ce réseau de microbes et de métabolites. En d’autres termes, la résilience de l'océan face aux changements planétaires (comme l’augmentation de la température et l’acidification) dépendra de la façon dont ce réseau réagit à ces perturbations.
En raison de sa courte durée de vie, ce pool de COD labile est difficilement observable. Ces métabolites microbiens constituent pourtant les voies les plus importantes dans l'océan du transport du carbone et sont assimilés par les bactéries marines comme sources de carbone et d’énergie. La connaissance des principales voies métaboliques (des gènes aux métabolites) est donc nécessaire pour modéliser les flux de carbone dans les océans. Pourtant, la diversité de ces molécules reste largement inexplorée et nombre d’entre elles n'ont pas de voies biosynthétique et/ou catabolique annotées. C’est le cas de l'homarine (N-méthylpicolinate), un composé abondant dans les océans. La teneur en homarine peut atteindre 400 mM chez la cyanobactérie marine Synechococchus (2) et cet organisme ubiquitaire contribue entre 10 et 20 % de la production primaire nette mondiale (3). L’homarine, par son abondance, est probablement un métabolite important dans le cycle du carbone.
Projet :
Dans ce projet de thèse, nous voulons élucider la voie de dégradation de l’homarine dans les océans.
Ruegeria pomeroyi DSS-3 est une bactérie aérobie à Gram négatif, membre du clade marin Roseobacter. Ses proches parents représentent environ 10-20 % du plancton bactérien de la couche mixte côtière et océanique (4). En laboratoire DSS-3 peut utiliser l'homarine comme seule source de carbone, mais on ne dispose à ce jour d’aucune information sur les gènes et les catabolites impliqués dans ce processus.
L'analyse comparative d’expériences de RNAseq menées sur des cultures de DSS-3 cultivées avec de l'homarine ou du glucose (contrôle)comme source de carbone permettra de repérer les gènes candidats impliqués dans la voie de dégradation. En parallèle, cette voie sera étudiée via une approche métabolomique par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à très haute résolution. La différence de profil entre des métabolomes de DSS-3 provenant de cellules cultivées sur glucose comme source de carbone et ceux issus de cellules cultivées sur homarine aidera à détecter les catabolites de la voie. Enfin, les gènes candidats seront clonés pour une expression recombinante dans E. coli, les protéines correspondantes purifiées et leur activité caractérisée afin de reconstruire l'ensemble de la voie de dégradation de l'homarine in vitro.
L’analyse de l’expression de ces gènes dans les données du projet Tara Océans (5) sera la première étape pour mieux comprendre le rôle
de l'homarine dans le cycle du carbone.
Références :
(1) doi.org/10.1038/358741a0
(2) doi.org/10.1128/mSystems.01334-20
(3) doi.org/10.1073/pnas.1307701110
(4) doi.10.1038/nature03170
(5) https://fondationtaraocean.org/expedition/tara-oceans/
Effet de la combinaison des radiations ionisantes et de molécules radio-sensibilisantes dans des modèles de cancer du sein
Le programme proposé vise à évaluer l'efficacité de molécules améliorant les effets de la radiothérapie, dans des modèles in vitro et in vivo de cancer du sein. Deux types de molécules, à savoir un inhibiteur de la maintenance du génome mitochondrial et un inhibiteur de la voie du Base Excision Repair feront l'objet d'un test d'efficacité de radiopotentialisation dans les modèles.
Les inhibiteurs pressentis, qu’ils ciblent la maintenance du génome mitochondrial ou la voie du BER, font déjà l’objet de recherches in vitro, au sein du laboratoire et chez des collaborateurs. Nous avons montré que l’inhibition des mécanismes étudiés permet une diminution de la réparation des cassures de l’ADN suivant un stress génotoxique. Durant ce projet, nous évaluerons les effets des inhibiteurs sur les réparations des dommages à l’ADN induits par les irradiations de différents types (conventionnelle, ultra haut débit de dose, voire débit de dose extrême), ainsi que les mécanismes associés.
Une variabilité de réponse aux combinaisons thérapeutiques est très fréquemment observée lors du passage des modèles in vitro aux modèles in vivo. Ainsi nous évaluerons les inhibiteurs d’une part sur des modèles de lignées cellulaires bien caractérisés au laboratoire, et correspondant à différents sous-types de cancer du sein. D’autre part, les études seront complétées par une validation des effets relevés in vitro sur un modèle murin de cancer du sein. Ce modèle de xénogreffes, développé dans des animaux immunocompétents, permet un suivi clinique, histologique, et immunitaire des animaux et de leurs tumeurs afin de confirmer l'intérêt des molécules pour une application thérapeutique en appui à la radiothérapie.
Ce programme bénéficiera des collaborations du laboratoire avec des physiciens et des chimistes, et des installations expérimentales et plateformes de l'IRCM (irradiation, expérimentation animale, microscopie, cytométrie, etc...)
Dynamique des protéines associées aux filaments nucléoprotéiques Rad51 - Implication dans la régulation de la recombinaison homologue
La recombinaison homologue (RH) est un mécanisme majeur de réparation des cassures double-brin de l'ADN induites par les radiations ionisantes. Une étape clé de la RH est la formation de filaments nucléoprotéique Rad51 sur l'ADN simple brin généré par ces cassures. Nous avons été les premiers a montré chez la levure qu'un contrôle strict de ces filaments est essentiel afin que la RH n'induise pas elle-même de réarrangements chromosomiques (eLife 2018, Cells 2021). Chez l'homme, les homologues fonctionnels des protéines de contrôle sont des suppresseurs de tumeurs. Ainsi, le contrôle de la RH semble être aussi important que le mécanisme de la RH lui-même. Notre projet implique l'utilisation de nouveaux outils moléculaires permettant une percée dans l'étude de ces contrôles. Nous utiliserons une version fonctionnelle fluorescente de la protéine Rad51 développée pour la première fois par nos collaborateurs A. Taddei (Institut Curie), R. Guérois et F. Ochsenbein (I2BC, Joliot, CEA). Cette avancée majeure nous permettra d'observer l'influence des protéines de contrôle sur la réparation de l'ADN par microscopie dans des cellules vivantes. Nous avons également développé des modèles structuraux très précis des complexes de protéines de contrôle en association avec les filaments Rad51. Nous recourrons à une approche multidisciplinaire basée sur la génétique, la biologie moléculaire, la microscopie, la biochimie et la structure des protéines en collaboration avec le laboratoire de W.D. Heyer (University of California, Davis, USA), pour comprendre la fonction des régulateurs de la formation des filaments Rad51. La description de l’organisation de ces protéines avec les filaments Rad51 nous permettra de développer de nouvelles approches thérapeutiques.
MÉTHYLATION DE L'ADN ET ORGANISATION 3D DU GÉNOME BACTÉRIEN
La méthylation de l'ADN chez les bactéries a été traditionnellement étudiée dans le contexte de la défense antiparasitaire. Cependant, les progrès du séquençage qui permettent l'analyse de la méthylation de l'ADN à l'échelle génomique se développent actuellement et ont propulsé une révolution épigénomique dans notre compréhension de l'étendue et de la pertinence physiologique de la méthylation. Généralement, la première étape de l'étude des impacts fonctionnels de la méthylation de l'ADN bactérien consiste à comparer l'expression globale des gènes entre des souches de type sauvage (WT) et des souches mutantes de méthyltransférase (MTase). Plusieurs études utilisant l'ARN-seq pour de telles comparaisons ont montré que la perturbation d'une seule MTase d'ADN entraîne souvent des dizaines, des centaines et parfois des milliers de gènes différentiellement exprimés (DE). Selon le modèle de compétition locale, la liaison compétitive entre une MTase et d'autres protéines liant l'ADN (par exemple, des facteurs de transcription) sur des sites de motifs spécifiques, affecte la transcription d'un gène voisin, entraînant une variation phénotypique au sein de la population bactérienne. Toutefois, si dans certains cas les effets régulateurs des MTases peuvent être attribués de manière concluante à la méthylation au niveau des promoteurs des gènes cibles, la grande majorité (>90%) des gènes DE n'ont pas de sites méthylés dans leurs régions promotrices, ce qui implique que les MTases ne sont pas des agents de régulation de la transcription, et que le modèle de compétition locale ne s'applique pas à la plupart des gènes DE. Une autre possibilité est que l'état de méthylation des motifs individuels régule l'expression d'un facteur de transcription, provoquant un large changement en aval dans l'expression de ses gènes cibles. Cependant, cette dernière hypothèse n'est pas suffisamment explicative pour un si grand nombre de gènes DE. Une hypothèse alternative concerne l'effet de la méthylation de l'ADN sur la topologie des chromosomes, en induisant des changements structurels qui modifient le répertoire des gènes exposés à la machinerie transcriptionnelle cellulaire. Nous avons récemment identifié CamA, une MTase core de Clostridioides difficile méthylant CAAAAA, qui joue un rôle dans la formation du biofilm, la sporulation et la transmission in vivo. De plus, dans une analyse ultérieure à grande échelle, nous avons découvert que CamA n'était que la partie émergée de l'iceberg, avec 45 % des espèces bactériennes de Genbank contenant au moins une MTase core ou quasi core, ce qui montre que ces dernières sont abondantes et suggère que leurs modifications épigénétiques sont également importantes pour les bactéries. En outre, des analogues de la S-adénosyl-l-méthionine (SAM) ont réussi à inhiber CamA, ce qui représente une première étape importante dans la création de thérapeutiques puissantes et sélectives ciblées sur l'épigénétique qui peuvent être exploitées comme nouveaux antimicrobiens.
Dans cette proposition de projet de doctorat, le candidat retenu est invité à déchiffrer l'interaction entre la méthylation bactérienne, l'organisation spatiale du génome et l'expression des gènes en répondant aux questions suivantes : i) la méthylation modifie-t-elle les domaines d'interaction chromosomique ? ii) les gènes DE et/ou les motifs de méthylation cibles sont-ils enrichis dans les limites des domaines d'interaction chromosomique modifiables ? iii) pouvons-nous modifier le méthylome (globalement ou localement) pour réprimer certains agents pathogènes humains ? Il / elle utilisera les technologies de séquençage Hi-C et long-read combinées à la génétique microbienne et à la génomique comparative pour faire progresser notre compréhension dans le domaine de l'épigénomique microbienne.
Dialogue entre les adipocytes et les lymphocytes T, acteurs clés de l’immunité dans le tissu adipeux
Le rôle métabolique et endocrine du tissu adipeux (TA) est établi. Le TA est composé majoritairement d’adipocytes mais aussi de cellules immunitaires, surtout connues pour contrôler l’homéostasie métabolique du tissu. L’activité immunitaire du TA est associée à la sécrétion de cytokines et de métabolites qui modulent la fonction immune. L’obésité, caractérisée par une accumulation de TA au niveau sous-cutané ou viscéral, est associée à une inflammation locale du TA. Pourtant, le TA peut être infecté par différents pathogènes et il constitue un site d’accumulation de lymphocytes T (LT) CD8 spécifiques de ceux-ci, qui protègent contre une réinfection. Ces données incitent donc à préciser lors d’une infection les interactions entre adipocytes et LT-CD8 du TA.
Le projet sera réalisé dans l’équipe CoVir qui développe divers projets visant à décrypter les propriétés anti-infectieuses du tissu adipeux. Il s’inscrit dans le cadre d’un consortium établi pour un projet ANR (INSERM, CNRS, Institut Pasteur de Lille). L’objectif du projet de l’équipe est d’étudier la contribution locale des adipocytes et des LT-CD8 résidants dans le TA au cours de l’infection par le virus de la grippe dans un modèle de primate non-humain (PNH). Le PNH présente des réponses métaboliques et immunitaire proches de l’homme. En complément des approches in-vivo chez le PNH, nous allons développer un modèle 3D de co-culture pour cibler l’interaction entre adipocytes et LT-CD8, sans interférence des signaux inflammatoires, métaboliques extérieurs au TA. Ce projet bénéficie de l’expertise historique développée dans l’institut (IMVA-HB UMR 1184/I IDMIT, dirigée par R. Le Grand) concernant l’étude des infections virales dans le modèle préclinique de PNH. Les plateformes de l’IDMIT mettent à disposition des équipements et une expertise en histologie, en cytométrie (LFC), de détection des cytokines/chimiokines (L2I) et pour le bien-être animal (ASW).
Le projet de thèse se concentrera sur les approches in vitro. Nous comparerons les interactions entre adipocytes et les LT, en étudiant la réponse métabolique et immunitaire de chacune de ces fractions. En effet, les cellules adipocytaires présentent une activité métabolique forte mais exercent une activité immunitaire propre (par la production de peptides microbicides) et une activité immuno-modulatrice. Concernant les cellules immunitaires, leur activité fonctionnelle est dépendante de leurs fonctions métaboliques et il est crucial d’évaluer les modifications immuno-métaboliques des cellules immunitaires en présence d’’adipocytes. Le modèle organoïde nous permettra d’évaluer : (i) l’impact du contexte d’obésité à celles dans un contexte de normalité métabolique, (ii) l’impact de pathogènes viraux sur chacune de ces deux fractions. A moyen terme, ce modèle permettra de tester des stratégies de modulation des fonctions du TA au cours des pathologies métaboliques ou des infections virales.
ROLE DE L'UNFOLDED PROTEIN RESPONSE DANS LE MAINTIEN DU STOCK DE CELLULES SOUCHES SPERMATOGONIALES CHEZ LA SOURIS ADULTE
Des conditions défavorables (stress oxydatif, déséquilibre des taux de lipides, de glucose ou de calcium, ou inflammation) provoquent l'accumulation de protéines anormales, induisant un stress du RE. L'Unfolded Protein Response (UPR) est activée pour restaurer l'homéostasie cellulaire, mais un stress sévère ou chronique entraîne la mort cellulaire par apoptose. Une dérégulation des voies de signalisation UPR favorise plusieurs maladies humaines (diabète, maladie de Parkinson, maladie d'Alzheimer, maladies du foie, cancer...), mais on ne sait rien de son rôle dans la stérilité de l'homme adulte.
La production de spermatozoïdes repose sur les cellules souches spermatogoniales (CSS) dont le stock est maintenu par autorenouvellement tout au long de la vie. Nous avons montré que l'activité clonogénique des CSS murines en culture est drastiquement réduite par induction de la différenciation cellulaire après induction d'un stress du RE. Un criblage HTS a identifié 2 des 3 branches UPR comme étant impliquées dans l'activité clonogénique des CSS de souris. Le rôle de ces 2 voies UPR sera étudié plus en détail afin de préciser si elles sont impliquées dans l'induction de mort cellulaire ou dans l'équilibre autorenouvellement/ différenciation. Dans les cultures de CSS de souris traitées, la mort cellulaire, le cycle cellulaire, l'induction de la différenciation et la synergie entre voies UPR seront analysés. L'effet de chaque voie étant médié par des facteurs transcriptionnels, les gènes cibles seront caractérisés par RNAseq afin d'identifier les réseaux géniques controlés par l'UPR impliqués dans le devenir des CSS. Pour la voie la plus pertinente, une étude in vivo permettra de confirmer le rôle du facteur UPR dans la fonction et le maintien des CSS.
Modèle d’organoïdes cérébraux complexes reproduisant la niche tumorale du glioblastome et sa composante immunitaire pour le développement d’une médecine personnalisée
Le glioblastome, responsable de 3 500 décès annuels en France, est une tumeur cérébrale extrêmement agressive et résistante aux traitements actuels. Les essais cliniques d’immunothérapie n’ont montré que des effets transitoires, soulignant l'importance de comprendre les mécanismes de résistance et de développer des stratégies thérapeutiques mieux ciblées.
Nous avons développé un modèle innovant d’invasion de cellules souches de gliome dans des organoïdes cérébraux immunocompétents et vascularisés, dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) (Raguin et coll. Soumis). Ce modèle reproduit fidèlement la niche tumorale du glioblastome, incluant la cooptation vasculaire, la reprogrammation de la microglie en macrophages associés aux tumeurs et la récurrence tumorale après radiothérapie.
L’objectif de ce projet de thèse est de dériver un modèle d’organoïdes cérébraux universel pour le transfert aux cellules de gliomes issues de patients et des lymphocytes afin d’optimiser l’approche d’immunothérapie (cellules CAR-T).
Il s’agira de créer un modèle universel d’organoïdes cérébraux humains immunitairement "silencieux" en supprimant l’expression du système HLA classes I/II dans les iPSC (CRISPR/CAS9 pour les gènes ß2M et CIITA). Par ailleurs, il s’agira d’élucider les mécanismes d’immunosuppression induits par l’irradiation, tels que la reprogrammation des cellules microgliales/macrophages et l’implication de la sénescence. Différentes approches visant à rendre le microenvironnement tumoral plus propice à l’immunothérapie seront explorées, comme en activant la voie de l'interféron de type I par modification génétique ou via des agonistes de la voie cGAS/STING. Par la suite, l'utilisation de cellules CAR-T ciblant un antigène surexprimé par les cellules de glioblastome (CD276/B7-H3) sera étudiée. Ce modèle pourra être utilisé en médecine personnalisée, en co-cultivant les cellules tumorales, les monocytes et les cellules CAR-T des patients.
Ce projet offre des perspectives innovantes pour le traitement personnalisé du glioblastome via l'immunothérapie et pourrait représenter une avancée majeure dans cette approche thérapeutique.
Suivi par imagerie in vivo multiplexée de la dissémination du pathogène et de la dynamique des réponses immunitaires dans un modèle de tuberculose
Cette thèse a pour objectif de mettre en place un suivi multiparamétrique par imagerie médicale à la fois de la colonisation d’un pathogène donné suite à une infection mais également de la dynamique des réponses immunitaires associées à cette infection, le tout à l’échelle de l’organisme entier. Cela pourrait fournir un outil innovant et non invasif permettant de mieux comprendre les liens entre la dynamique dans le temps et dans l’espace des réponses immunitaires et la bio-distribution du pathogène dans l’organisme, et potentiellement fournir de nouveaux biomarqueurs associés à différentes maladies.
Pour ce faire, cette thèse s’appuierait sur la pathologie de la tuberculose qui représente un enjeu majeur de santé publique à ce jour dans le monde. L'objectif principal est de déterminer la relation entre la dissémination de Mycobacterium tuberculosis et les réponses immunitaires associées à travers tout le corps au cours de l'infection tuberculeuse, de l'infection précoce à la tuberculose latente ou active, grâce à des protocoles d'imagerie multiplexée innovants. Le but de cette étude est de fournir des corrélations dans le temps et dans l'espace entre la charge bactérienne locale et plusieurs infiltrations de cellules immunitaires (macrophages activés et sous-ensembles de lymphocytes T) survenant après l'infection et détectées au fil du temps par imagerie. Ces résultats pourraient alors fournir, avec une invasivité minimale, des biomarqueurs prédictifs de la progression de la maladie et pourraient également offrir des informations précieuses sur les cibles immunitaires potentielles pour de futures stratégies préventives ou curatives basées sur la modulation du système immunitaire. Pour ce faire, cette thèse tirerait parti du modèle préclinique de tuberculose chez le primate non humain développé en France et de notre expertise en imagerie in vivo des pathogènes et des cellules immunitaires dans ce modèle. Il est à noter que la caractérisation plus approfondie des cellules immunitaires dans les échantillons d'intérêt (guidés par imagerie) sera évalué par des technologies de transcriptomique spatiale ou unicellulaire sur des échantillons de tissus, afin de fournir des informations supplémentaires sur la physiopathologie de la tuberculose et l'efficacité des traitements potentiels.