Implication des protéines paralogues de Rad51 dans la formation des filaments Rad51 lors de la réparation de l'ADN
La recombinaison homologue (RH) est un mécanisme majeur de réparation des cassures double-brin de l'ADN induites par les radiations ionisantes. Une étape clé de la RH est la formation de filaments nucléoprotéique Rad51 sur l'ADN simple brin généré par ces cassures. Nous avons montré qu'un contrôle strict de ces filaments est essentiel, afin que la RH n'induise pas elle-même des réarrangements chromosomiques (eLife 2018, Cells 2021). Chez l'homme, les homologues fonctionnels des protéines de contrôle sont des suppresseurs de tumeurs. Ainsi, le contrôle de la RH semble être aussi important que le mécanisme de la RH lui-même. Notre projet implique l'utilisation de nouveaux outils moléculaires permettant une véritable percée dans l'étude de ces contrôles. Nous utiliserons une version fonctionnelle fluorescente de la protéine Rad51 développée pour la première fois par nos collaborateurs A. Taddei (Institut Curie), R. Guérois et F. Ochsenbein (I2BC, Joliot, CEA). Cette avancée majeure nous permettra d'observer l'influence des protéines de contrôle sur la réparation de l'ADN par microscopie dans des cellules vivantes. Nous avons également développé des modèles structuraux très précis des mégacomplexes de protéines de contrôle en association avec les filaments Rad51. Cette étude a également conduit à l'identification de domaines spécifiques pour chaque protéine paralogue, en dehors du noyau structurellement conservé de type Rad51, qui pourraient définir la spécificité de chaque protéine paralogue. Nous utiliserons une approche multidisciplinaire basée sur la génétique, la biologie moléculaire, la biochimie, la structure des protéines et des méthodes de microscopie, et la levure comme organisme modèle pour étudier les conséquences de l'ablation de ces domaines spécifiques. Nous rechercherons également des protéines liant spécifiquement ces domaines. Leur identification sera cruciale pour comprendre la fonction des complexes paralogues de Rad51 et aideront à développer de nouvelles approches thérapeutiques.
Les protéines de type prion dans le plancton marin: à la recherche de nouveaux facteurs moléculaires de l’adaptation aux changements de température
Le changement climatique remodèle la répartition des espèces sur la planète et les mécanismes d’adaptation au stress thermique sont alors sollicité. Récemment, chez les plantes terrestres le rôle des protéines de type prion a été mis en évidence dans les mécanismes de floraison et de vernalisation. Ces protéines atypiques n’ont cependant pas été recherché dans le monde marin où le plancton joue un rôle essentiel dans la pompe à carbone biologique et le réseau trophique marin. Pour explorer le monde des protéines de type prion et leur rôle dans l'adaptation aux changement de température des espèces planctoniques marines, nous proposons un programme de doctorat de trois ans au sein de l'équipe de biologie computationnelle du CEA-SEPIA à l'Institut de biologie François Jacob situé à Fontenay-aux-Roses, France. Le premier objectif est d'identifier et de caractériser la fonction des protéines marines de type prion ainsi que leur biogéographie dans les océans du monde. Le doctorant reconstruira également l'évolution moléculaire de ces protéines à travers un large spectre d'espèces de plancton marin grâce à des analyses de gain/perte de gènes et de signaux d'adaptation moléculaire. L'approche de recherche s'appuiera sur la génomique et la phylogénie comparatives à partir des données métagénomiques et métatranscriptomiques de Tara Oceans. De plus, l'étudiant identifiera des protéines de type prion impliquées dans l'adaptation aux changements de température en intégrant les données spatiales et environnementales collectées par les expéditions Tara Oceans. Dans un contexte du changement climatique actuel, cette recherche s’intègre dans la compréhension de l’évolution moléculaire des protéines de type prion, éclairant leur rôle dans l’adaptation d’espèces jouant un rôle clé dans les écosystèmes marins.
PPARy, un acteur majeur de l'homéostasie du stroma médullaire et une cible thérapeutique pour la myélofibrose ?
La myélofibrose (MF) est la plus grave des néoplasies myéloprolifératives (NMP) Philadelphie négative avec une médiane de survie de 5-6 ans. Qu'elle soit diagnostiquée de novo (MyéloFibrose Primitive, PMF) ou qu'elle apparaisse secondairement à une autre NMP, les caractéristiques de la MF sont semblables. Une sous-population de cellules hématopoïétiques issues du clone pathologique libère dans le microenvironnement médullaire des cytokines pro-inflammatoires et des facteurs de croissance. En réponse, le microenvironnement médullaire va subir un remodelage engendrant une ostéosclérose ainsi qu'une fibrose des cellules stromales mésenchymateuses (MSC) associée à une perte du soutien hématopoïétique. La classification OMS de 2016 intègre un état de prémyélofibrose favorisant le diagnostic précoce des patients présentant un risque accru d'évolution. Toutefois, si des progrès majeurs ont été réalisés sur la pathogénèse de la maladie, avec notamment la description des mutations dites « drivers » responsables de la myéloprolifération (JAK2, CALR et MPL), en dehors de l'allogreffe de cellules souches hématopoïétiques qui ne concerne qu'une minorité de patients, les traitements actuels sont principalement symptomatiques et ont peu d'influence sur l'histoire naturelle de la MF.
Récemment, nous avons démontré que l'activation du récepteur nucléaire PPARy (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-gamma) par ses ligands pharmacologiques (Actos®) ou (Pentaza®) permettait de réduire le développement de l'ostéosclérose, de la fibrose réticulinique de la moelle osseuse (MO) et de prévenir l'anémie conséquente au remodelage médullaire dans trois modèles précliniques murins de la MF (Lambert, Saliba et al. 2021). Ces résultats positionnent les agonistes de PPARy comme des candidats thérapeutiques intéressants. Cependant, avant d'envisager leur repositionnement thérapeutique dans la prise en charge de la MF, il est impératif de caractériser le statut et la fonction de PPARy au sein des MSC médullaires tant au stade physiologique que lors du développement des NMP.
Dans ce projet, nos premiers résultats montrent que l'expression de PPARy est diminuée dans les MSC murines et humaines au stade de MF. En revanche aucune modification de l'expression de PPARy n'est observée dans les MSC issues des autres NMP. Les analyses transcriptomiques démontrent également que le TGF-B, une cytokine majeure du développement de la MF, est capable de réguler négativement l'expression de PPARy dans les MSC. Afin de mimer ce défaut d'expression, nous avons invalidé PPAR-y (KO) dans deux lignées de MSC médullaires, la première murine (MS5), la seconde humaine (HS5, en cours de caractérisation). Dans ces conditions, l'expression basale d'un panel de gènes associés à la MF est augmenté dans les MSC-KO au niveau de celle des lignées sauvages stimulées par le TGF-B. L'expression de ce panel est encore augmentée dans les MSC-KO en présence de TGF-B, indiquant une potentialisation du signal médié par le TGF-B en l'absence de PPARy. Cette signature transcriptomique associée aux MSC-KO est retrouvée dans les MSC murines issues du modèle de MF induite par la thrombopoïétine (TPOhigh) ainsi que dans les MSC humaines en provenance de patients présentant une PMF. En revanche ce profil d'expression n'est pas retrouvé dans les MSC de patients présentant une autre NMP, indiquant qu'il signe bien un stade de MF.
L'invalidation de PPARy n'affecte pas la signature phénotypique des MSC médullaires, toutefois leur caractère multipotent est altéré avec une perte de la capacité de différentiation adipocytaire associée à une augmentation du potentiel de différentiation ostéo-chondrocytaire. Ces observations histologiques sont corroborées par la diminution de la production des facteurs adipocytaires par les MSC-KO et une augmentation de l'expression du facteur ostéoblastique Runx-2. De plus, le surnageant de la lignée KO présente une forte augmentation de l'ostéoprotégérine (OPG), molécule soluble produite par les ostéoblastes qui entraine l'apoptose des ostéoclastes. Cette dérégulation de la balance ostéoblaste/ostéoclaste en condition KO pourrait rendre compte de l'ostéosclérose observée chez les patients présentant une MF. De plus, les productions de CXCL12 (CXC motif Chemokine Ligand 12) et le facteur de croissance médullaire SCF (c-kit ligand) sont fortement diminués en condition MSC-KO, tant au niveau transcriptomique que protéique. Ces données récapitulent les résultats décrits lors des analyses transcriptomiques des MSC de patients présentant une fibrose. Parallèlement, la capacité des MSC-KO à soutenir l'hématopoïèse, à court et long terme, est significativement diminuée reflétant les cytopénies associées à la MF.
In silico, des analyses de RNA-Seq ont été réalisées sur les lignées MS5-WT et MS5-KO. Les premières analyses d'enrichissement d'ensembles de gènes (GSEA) montrent que les voies les plus significativement affectées concernent l'inflammation, la myogénèse (transition MSC vers myofibroblaste) et le cycle cellulaire. Des analyses complètes doivent maintenant être réalisées pour mettre en évidence de nouveaux gènes candidats thérapeutiques et mieux comprendre le développement de la fibrose médullaire.
Ces premiers résultats in vitro, soutiennent le rôle clé du récepteur PPARy dans l’homéostasie du microenvironnement médullaire et dans la genèse de son remodelage lors du développement de la myélofibrose. Toutefois, les approches in vitro ne peuvent pas à elles seules récapituler toute la complexité d’une pathologie impliquant de multiples intervenants comprenant les cellules hématopoïétiques, immunologiques et l’ensemble des types cellulaires composants le microenvironnement médullaire. Pour intégrer tous ces paramètres nous avons établi un modèle murin ou l’expression de PPARy est réduite (haplo-insuffisance) ou invalidée (KO) dans les MSC médullaires des animaux. C’est l’étude de ce modèle qui constituera le cœur du projet. Il permettra dans un premier temps, in vivo :
1) De caractériser le rôle de PPARy dans l’homéostasie du microenvironnement médullaire.
2) D’évaluer l’impact de la diminution de son expression sur le développement de la fibrose médullaire.
3) De valider le positionnement de PPARy comme cible thérapeutique dans la prise en charge de la fibrose médullaire et d’envisager le repositionnement de ses agonistes pharmacologiques (Actos® ; (Pentaza®) dans cette pathologie.
La présence d’une pré-fibrose/fibrose médullaire est un facteur de mauvais pronostic dans les NMP ou les leucémies aiguës myéloïdes (LAM). Cependant il est difficile de déterminer si cet état constitue simplement un marqueur ou s’il a un rôle actif dans le développement des hémopathies. L’utilisation de ces modèles (Haplo-insuffisants ou KO pour PPARy dans les MSC) en association avec les modèles précliniques murins de NMP (LMC (BCR-ABL) ; Polyglobulie de Vaquez (JAK2 V617F), Thrombocytémie essentielle (CALRDel52)) permettra de déterminer dans un second temps si :
1) La présence d’une prédisposition à la fibrose médullaire influe sur l’histoire naturelle des hémopathies.
2) Dans ces pathologies qui sont à l’origine purement hématopoïétiques (mutation de la cellule souche hématopoïétique), il est pertinent d’associer au traitement ciblant le clone malin un traitement visant à prévenir le développement de la fibrose médullaire (activation du récepteur PPARy par ses ligands dans la condition d’haplo-insuffisance).
L’ensemble de ce projet se place dans le cadre des biotechnologies de demain (F), visant à améliorer la prise en charge des patients en développant une médecine personnalisée.
Imagerie par tomographie par émission de positons de l'astrogliose associée à la maladie d'Alzheimer
Ce sujet de thèse se focalise sur l’évaluation de la réactivité astrocytaire induite par la tauopathie associée à la maladie d'Alzheimer, par imagerie TEP ou autoradiographie 3D en utilisant le radioligand [11C] BU99008 ou [3H]BU99008, spécifique des récepteurs I2-BS, cible de la réactivité astrocytaire. Les objectifs principaux de ce projet de recherche sont les suivants : 1- valider la spécificité de la liaison du ligand [11C]/[3H]BU99008 dans divers modèles de tauopathie, 2- caractériser la signature des astrocytes réactifs détectés par le BU99008, et 3- évaluer la fixation spécifique du [11C]/[3H]BU99008, ainsi que l'expression génique suite à une stratégie thérapeutique ciblant les récepteurs I2-BS dans un des modèles de tauopathie. Notre approche méthodologique adopte une perspective multi-échelle combinant l'imagerie TEP avec des analyses microscopiques et transcriptomiques, permettant ainsi une analyse multi-échelle allant du macro (in vivo) au micro (in vitro). Ces études ne se limitent pas seulement à la compréhension fondamentale de la réactivité astrocytaire, mais ouvrent également des perspectives importantes pour le développement de stratégies thérapeutiques visant la réactivité astrocytaire dans le contexte des maladies neurodégénératives.
Effet des radiations ionisantes et utilisation de molécules radio-sensibilisantes dans un modèle murin de cancer du sein pertinent et modulable
Le programme proposé vise à évaluer l'efficacité de molécules améliorant les effets de la radiothérapie, dans des modèles in vitro et in vivo de cancer du sein.
D'une part, des nanoparticules bi-métalliques développées au laboratoire feront l'objet d'un test d'efficacité de radiopotentialisation, principalement dans un modèle murin immunocompétent. Un suivi clinique, histologique, et immunitaire des animaux et de leurs tumeurs permettra de confirmer l'intérêt de ces molécules pour une application thérapeutique en appui à la radiothérapie. De plus, ces nanoparticules innovantes ont été conçues comme biodosimètres, utilisant des propriétés physiques remarquables des nanoparticules métalliques. Le projet inclut également l'évaluation de ce potentiel de biodosimétrie, en collaboration étroite avec des équipes de physiciens du CEA qui ont développé des outils de détection.
D'autre part, des inhibiteurs spécifiques d'une protéine de réparation de l'ADN seront utilisés afin de bloquer les réparations suivant l'irradiation. Ainsi, les cellules cancéreuses endommagées seront dirigées vers une mort cellulaire, y compris les cellules contournant habituellement les dommages induits à l'ADN par la radiothérapie. L'objectif du programme de thèse est d'évaluer les effets de ces molécules sur des modèles cellulaires in vitro, et aussi dans des modèles murins.
Le programme proposé bénéficiera des collaborations du laboratoire avec des physiciens et des chimistes, et des installations expérimentales et plateformes de l'IRCM (irradiation, expérimentation animale, microscopie, cytométrie, etc...)
Les lymphocytes T bystanders cytotoxiques intra-tumoraux au potentiel anti-tumoral sont inhibés par le checkpoint HLA-G/ILT2 : étude d’un nouveau paradigme aux perspectives thérapeutiques
Objectif de la thèse : participer à la thématique de recherche résumée ci-dessous et en prendre en charge une partie. Ce projet est financé par un PRT-K et est un travail collaboratif Saclay/Paris/Grenoble
Connaissances en immunologie et techniques de base d’immunologie. Multidisciplinarité valorisée, en particulier en rapport avec la bio-informatique/bio-statistique.
Résumé de la thématique de recherche 2023-2025
Les lymphocytes T spécifiques pour des antigènes de tumeurs jouent un role central dans l’immunité anti-tumorale et l’immunothérapie. Cependant, les données récentes montrent qu’ils ne constituent qu’une fraction des lymphocytes T infiltrant les tumeurs (TILs), et que nombreux sont les TILs (appelés ‘bystanders’) qui reconnaissent des antigènes non tumoraux.
Des stratégies immunothérapeutiques utilisant ces lymphocytes T bystanders sont au stade préclinique. Nos travaux sur le checkpoint inhibiteur HLA-G/ILT2 chez les patients atteints de cancers urologiques montrent qu’à côté des TILs PD1+ connus pour être de spécificités antitumorales, les TILs ILT2+ constituent un réservoir conséquent de lymphocytes hautement cytotoxiques, sensibles à une inhibition par HLA-G mais pas par PDL1, et de ce fait insensibles aux immunothérapies anti-PD1/-PDL1. Ces TILs ILT2+ sont anti-viraux, et leur activation peut être de type innée, indépendante du TCR. Les lymphocytes T ILT2+ sont donc des TILs bystanders potentiellement anti-tumoraux. Cette situation est spécifiquement humaine et non observable dans les modèles animaux chez qui le checkpoint HLA-G/ILT2 n’existe pas. La transition du préclinique à la clinique requiert donc des études chez l’homme.
Notre but est de démontrer dans les cancers urologiques, que
(i) lors du design de nouvelles immunotherapies fondées sur les TILs bystanders, HLA-G, leur principal checkpoint inhibiteur doit absolument être pris en compte,
(ii) une stratégie thérapeutique peut tirer profit de la population conséquente de bystanders ILT2+ intratumoraux et de leur important reservoir de précurseurs périphériques, pour rediriger leurs fonctions spécifiquement vers les cellules tumorales tout en bloquant leur principal checkpoint inhibiteur HLA-G.
Pour atteindre cet objectif, nous avons réuni des scientifiques du CEA en onco-immunologie (Paris) et bio-informatique (Grenoble), et des oncologues, urologues et anatomo-pathologistes de l'hôpital Saint-Louis (Paris)
Transmission sexuelle de la variole du singe: Compréhension de la pathogenèse, de l'immunité et du développement de vaccins dans un modèle de primate non humain (MONKIVAX)
En 2022-2023, une épidémie mondiale sans précédent du virus de la variole du singe (monkeypox), un virus à ADN double brin lié à la variole, a émergé dans des régions non endémiques, provoquant plus de 87,000 cas signalés dans 170 pays. Cela a incité l'OMS à la classer comme une Urgence de Santé Publique de Portée Internationale. La France seule a documenté 5,014 cas, dont 83% ont été confirmés biologiquement.
La souche responsable de l'épidémie de 2022-2023 a été identifiée comme la lignée B.1 ouest-africaine, Clade 2b, connue sous le nom de "mpox". Cette épidémie s'est caractérisée par sa propagation rapide à l'échelle mondiale, des symptômes cliniques uniques et une forte prévalence parmi les hommes ayant des relations sexuelles avec d'autres hommes (HSH). La transmission du mpox peut se faire par divers modes de contact, mais le contact sexuel joue un rôle significatif, avec plus de 91% des cas qui y sont liés. Des lésions dans les régions génitales, péri-anales et buccales suggèrent une transmission sexuelle, et de l'ADN du virus a été trouvé dans le sperme des patients infectés.
Aucun vaccin spécifique contre le mpox n'existe, mais des preuves antérieures indiquent que les vaccins antivarioliques peuvent offrir une certaine protection en raison de la réaction croisée. JYNNEOSTM, un vaccin à base de Modified Vaccinia Ankara (MVA) vivant et non réplicatif, a récemment été approuvé pour la prévention du mpox, mais a montré une efficacité variable contre l'épidémie de 2022, mettant en évidence la nécessité de vaccins plus efficaces.
La compréhension de la pathogenèse, de l'immunité et de la transmission du mpox est limitée, en particulier lors de l'épidémie récente. Pour répondre à ces questions, une étude utilisant des macaques cynomolgus comme modèle pour simuler une infection muqueuse par le mpox avec la souche actuelle de l'épidémie est proposée.
Le projet a deux objectifs principaux :
1) Élucider les mécanismes de la pathogenèse du mpox et la réponse immunitaire à l'infection naturelle en utilisant un modèle de transmission sexuelle chez les primates non humains (PNH).
2) Évaluer la réponse immunitaire provoquée par le vaccin MVA contre la voie de transmission sexuelle chez les PHN, et identifier de nouveaux mécanismes que les futurs candidats vaccins pourraient devoir activer pour améliorer l'efficacité des nouveaux vaccins et renforcer la réponse immunitaire à la vaccination.
Dans ce projet de thèse, l'étudiant recevra une formation complète en immunologie, virologie et microbiologie, couvrant à la fois les aspects théoriques et pratiques. Cette formation comprendra le développement de diverses techniques expérimentales pour étudier la transmission des virus et la réponse immunitaire de l'hôte à l’infection et à la vaccination. De plus, des approches in vivo seront utilisées en utilisant un modèle de PNH. Le candidat au doctorat acquerra une compétence dans un large éventail de techniques, telles que les cultures cellulaires, la cytométrie en flux, l'histologie, la transcriptomique et bien plus encore.
Dans l'ensemble, ce projet vise à approfondir notre compréhension de la pathogenèse et de l'immunité du mpox, à orienter le développement de vaccins et à contribuer aux efforts de santé publique pour lutter contre cette maladie infectieuse émergente.
Conception d’empreinte moléculaire à base d’aptamères pour le diagnostic des maladies neurodégénératives.
Le projet de thèse consiste à développer un nouveau type de diagnostique capable de détecter la signature d’une forme de protéine pathologique. Le but est de pouvoir améliorer le diagnostic des patients souffrant de protéinopathies neurodégénératives distinctes dues à l’agrégation des protéines alpha-synucléine et tau, notamment les maladies de Parkinson ou d'Alzheimer. Ce projet s'appuie sur l'expertise de notre équipe dans la technologie des aptamères (ligands à base d'acides nucléiques) et la production d’agrégats structuralement distincts d’alpha-synucléine et tau dont nous avons démontré qu’ils peuvent induire l’apparition de différentes formes de synucleinopathies et de tauopathies. Au cours de cette thèse, différentes banques d'aptamères seront évaluées contre plusieurs polymorphes de fibre de protéines retrouvées dans différentes maladies. Ces aptamères seront ensuite utilisés pour concevoir un test diagnostique selon un procédé que nous avons récemment breveté (AptaFOOT-Seq). L’étudiant devra avoir un gout prononce´ pour la recherche biomédicale et notamment par les aspects moléculaires de la biologie. Cette thèse lui permettra une formation approfondie en synthèse et purification d’ARN et de protéines, en évolution moléculaire dirigée, en PCR quantitative (qPCR et droplet PCR), en séquençage a` haut-de´bit, en analyse bio-informatique et en biochimie structurale. L’aboutissement de la thèse est d’obtenir des résultats valorisables en termes de propriété´ intellectuelle et de permettre a` l’étudiant d’envisager une carrie`re dans un environnement acade´mique ou industriel.
Réponse des Cellules Souches Spermatogoniales à une irradiation par les ions lourds : évaluation fonctionnelle et transcriptome chez la souris adulte.
Dans l'espace profond, les astronautes seront exposés au rayonnement cosmique galactique, dont les ions lourds de forte énergie, éléments minoritaires, sont très toxiques pour les cellules. Les conséquences sur l'organisme de ces expositions chroniques à faible dose restent mal connues faute de données chez l'homme. Afin d'évaluer l'impact d'un séjour prolongé dans l'espace sur la fertilité masculine, ce projet propose d'étudier les effets d'une irradiation par un faisceau d'ions 56Fe sur les cellules souches spermatogoniales (CSS) de souris. Chez l'adulte, la production continue de spermatozoïdes repose sur un stock de CSS pérennisé par autorenouvellement. L'intégrité de l'activité des CSS irradiées sera testée in vivo par des tests de transplantation. Différents paramètres des CSS irradiées seront analysés (lésions dans l'ADN, mortalité, cycle cellulaire...). Une signature transcriptionnelle et des marqueurs de l'exposition aux ions lourds seront recherchés dans les spermatogonies indifférenciées (single cell - RNA seq), et les réseaux géniques des réponses au stress seront particulièrement étudiés. L'ensemble de ces données pourra servir de base à l'étude du risque héréditaire et épigénétique lié à ces séjours spatiaux, mais également à l'amélioration des mesures de protection.