Localisation et dynamique des protéines clés associées au nucléoïde au cours du remodelage du nucléoïde bactérien induit par le stress.
Le remodelage, et en particulier, la compaction de nucléoïdes, est un mécanisme commun de réponse au stress chez les bactéries, qui leur permet de réagir rapidement aux changements soudains de leur environnement. Par des approches de microscopie optique avancées, nous avons récemment suivi les changements de morphologie et de volume des nucléoïdes induits par l'exposition au rayonnement UV-C dans la bactérie radio-résistante, Deinococcus radiodurans. Ce processus en deux étapes implique une condensation initiale rapide du nucléoïde suivie d'une phase de décompaction plus lente pour restaurer la morphologie normale du nucléoïde, avant que la croissance et la division cellulaires ne puissent reprendre. Les protéines associées aux nucléoïdes (NAP) sont connues pour être des acteurs clés de ce processus, bien que les détails de leur implication restent encore peu décrits. Nous avons commencé à faire la lumière sur le rôle central de la principale NAP, la protéine HU, dans ce processus. Le projet de thèse que nous proposons prévoit d'étendre ce travail à 5 autres NAPs impliquées dans le processus de remodelage des nucléoïdes induit par le stress. Le/la doctorant(e) effectuera des études biochimiques pour suivre l'abondance de ces facteurs clés, de la microscopie de fluorescence pour cartographier leurs distributions et du suivi de particules uniques pour déterminer leurs dynamiques. Ces travaux nous permettront d'approfondir nos connaissances sur les processus fondamentaux qui régissent l'organisation du génome bactérien et comment ils sont affectés par le rayonnement UV et les dommages à l'ADN.
PPARy, un acteur majeur de l'homéostasie du stroma médullaire et une cible thérapeutique pour la myélofibrose ?
La myélofibrose (MF) est la plus grave des néoplasies myéloprolifératives (NMP) Philadelphie négative avec une médiane de survie de 5-6 ans. Qu'elle soit diagnostiquée de novo (MyéloFibrose Primitive, PMF) ou qu'elle apparaisse secondairement à une autre NMP, les caractéristiques de la MF sont semblables. Une sous-population de cellules hématopoïétiques issues du clone pathologique libère dans le microenvironnement médullaire des cytokines pro-inflammatoires et des facteurs de croissance. En réponse, le microenvironnement médullaire va subir un remodelage engendrant une ostéosclérose ainsi qu'une fibrose des cellules stromales mésenchymateuses (MSC) associée à une perte du soutien hématopoïétique. La classification OMS de 2016 intègre un état de prémyélofibrose favorisant le diagnostic précoce des patients présentant un risque accru d'évolution. Toutefois, si des progrès majeurs ont été réalisés sur la pathogénèse de la maladie, avec notamment la description des mutations dites « drivers » responsables de la myéloprolifération (JAK2, CALR et MPL), en dehors de l'allogreffe de cellules souches hématopoïétiques qui ne concerne qu'une minorité de patients, les traitements actuels sont principalement symptomatiques et ont peu d'influence sur l'histoire naturelle de la MF.
Récemment, nous avons démontré que l'activation du récepteur nucléaire PPARy (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-gamma) par ses ligands pharmacologiques (Actos®) ou (Pentaza®) permettait de réduire le développement de l'ostéosclérose, de la fibrose réticulinique de la moelle osseuse (MO) et de prévenir l'anémie conséquente au remodelage médullaire dans trois modèles précliniques murins de la MF (Lambert, Saliba et al. 2021). Ces résultats positionnent les agonistes de PPARy comme des candidats thérapeutiques intéressants. Cependant, avant d'envisager leur repositionnement thérapeutique dans la prise en charge de la MF, il est impératif de caractériser le statut et la fonction de PPARy au sein des MSC médullaires tant au stade physiologique que lors du développement des NMP.
Dans ce projet, nos premiers résultats montrent que l'expression de PPARy est diminuée dans les MSC murines et humaines au stade de MF. En revanche aucune modification de l'expression de PPARy n'est observée dans les MSC issues des autres NMP. Les analyses transcriptomiques démontrent également que le TGF-B, une cytokine majeure du développement de la MF, est capable de réguler négativement l'expression de PPARy dans les MSC. Afin de mimer ce défaut d'expression, nous avons invalidé PPAR-y (KO) dans deux lignées de MSC médullaires, la première murine (MS5), la seconde humaine (HS5, en cours de caractérisation). Dans ces conditions, l'expression basale d'un panel de gènes associés à la MF est augmenté dans les MSC-KO au niveau de celle des lignées sauvages stimulées par le TGF-B. L'expression de ce panel est encore augmentée dans les MSC-KO en présence de TGF-B, indiquant une potentialisation du signal médié par le TGF-B en l'absence de PPARy. Cette signature transcriptomique associée aux MSC-KO est retrouvée dans les MSC murines issues du modèle de MF induite par la thrombopoïétine (TPOhigh) ainsi que dans les MSC humaines en provenance de patients présentant une PMF. En revanche ce profil d'expression n'est pas retrouvé dans les MSC de patients présentant une autre NMP, indiquant qu'il signe bien un stade de MF.
L'invalidation de PPARy n'affecte pas la signature phénotypique des MSC médullaires, toutefois leur caractère multipotent est altéré avec une perte de la capacité de différentiation adipocytaire associée à une augmentation du potentiel de différentiation ostéo-chondrocytaire. Ces observations histologiques sont corroborées par la diminution de la production des facteurs adipocytaires par les MSC-KO et une augmentation de l'expression du facteur ostéoblastique Runx-2. De plus, le surnageant de la lignée KO présente une forte augmentation de l'ostéoprotégérine (OPG), molécule soluble produite par les ostéoblastes qui entraine l'apoptose des ostéoclastes. Cette dérégulation de la balance ostéoblaste/ostéoclaste en condition KO pourrait rendre compte de l'ostéosclérose observée chez les patients présentant une MF. De plus, les productions de CXCL12 (CXC motif Chemokine Ligand 12) et le facteur de croissance médullaire SCF (c-kit ligand) sont fortement diminués en condition MSC-KO, tant au niveau transcriptomique que protéique. Ces données récapitulent les résultats décrits lors des analyses transcriptomiques des MSC de patients présentant une fibrose. Parallèlement, la capacité des MSC-KO à soutenir l'hématopoïèse, à court et long terme, est significativement diminuée reflétant les cytopénies associées à la MF.
In silico, des analyses de RNA-Seq ont été réalisées sur les lignées MS5-WT et MS5-KO. Les premières analyses d'enrichissement d'ensembles de gènes (GSEA) montrent que les voies les plus significativement affectées concernent l'inflammation, la myogénèse (transition MSC vers myofibroblaste) et le cycle cellulaire. Des analyses complètes doivent maintenant être réalisées pour mettre en évidence de nouveaux gènes candidats thérapeutiques et mieux comprendre le développement de la fibrose médullaire.
Ces premiers résultats in vitro, soutiennent le rôle clé du récepteur PPARy dans l’homéostasie du microenvironnement médullaire et dans la genèse de son remodelage lors du développement de la myélofibrose. Toutefois, les approches in vitro ne peuvent pas à elles seules récapituler toute la complexité d’une pathologie impliquant de multiples intervenants comprenant les cellules hématopoïétiques, immunologiques et l’ensemble des types cellulaires composants le microenvironnement médullaire. Pour intégrer tous ces paramètres nous avons établi un modèle murin ou l’expression de PPARy est réduite (haplo-insuffisance) ou invalidée (KO) dans les MSC médullaires des animaux. C’est l’étude de ce modèle qui constituera le cœur du projet. Il permettra dans un premier temps, in vivo :
1) De caractériser le rôle de PPARy dans l’homéostasie du microenvironnement médullaire.
2) D’évaluer l’impact de la diminution de son expression sur le développement de la fibrose médullaire.
3) De valider le positionnement de PPARy comme cible thérapeutique dans la prise en charge de la fibrose médullaire et d’envisager le repositionnement de ses agonistes pharmacologiques (Actos® ; (Pentaza®) dans cette pathologie.
La présence d’une pré-fibrose/fibrose médullaire est un facteur de mauvais pronostic dans les NMP ou les leucémies aiguës myéloïdes (LAM). Cependant il est difficile de déterminer si cet état constitue simplement un marqueur ou s’il a un rôle actif dans le développement des hémopathies. L’utilisation de ces modèles (Haplo-insuffisants ou KO pour PPARy dans les MSC) en association avec les modèles précliniques murins de NMP (LMC (BCR-ABL) ; Polyglobulie de Vaquez (JAK2 V617F), Thrombocytémie essentielle (CALRDel52)) permettra de déterminer dans un second temps si :
1) La présence d’une prédisposition à la fibrose médullaire influe sur l’histoire naturelle des hémopathies.
2) Dans ces pathologies qui sont à l’origine purement hématopoïétiques (mutation de la cellule souche hématopoïétique), il est pertinent d’associer au traitement ciblant le clone malin un traitement visant à prévenir le développement de la fibrose médullaire (activation du récepteur PPARy par ses ligands dans la condition d’haplo-insuffisance).
L’ensemble de ce projet se place dans le cadre des biotechnologies de demain (F), visant à améliorer la prise en charge des patients en développant une médecine personnalisée.
Implication des prokinéticines dans les troubles cérébrovasculaire associés à la prééclampsie : enjeux thérapeutiques
La prééclampsie (PE) est une complication spécifique de la grossesse associée à une hypertension et une hypoperfusion du placenta, entraînant un risque accru d'issues néonatales fœtales et maternelles défavorables, et des conséquences sur les fonctions neurovasculaires. Or la PE ne se limite pas à la grossesse et, plus de 20 ans après, les femmes présentent des risques accrus d'accident vasculaire cérébral et des troubles cognitives. Les études cliniques ont mis en évidence par IRM que ces patientes présentaient des lésions cérébrales. Les travaux de MAB2 ont démontré, dans un modèle murin de PE, l'implication directe des prokinéticines (PROKs) ainsi que de leurs récepteurs (PROKRs), dans l’établissement de la PE et de ses symptômes. Nos résultats récents démontrent le lien direct entre l’événement prééclamptique et l’apparition de lésions et d’une inflammation cérébrales tardives. De plus, sur un modèle cellulaire des vaisseaux du cerveau, la barrière hématoencéphalique (BHE), nous avons démontré que les PROKs modifient la perméabilité vasculaire. Le but du projet de thèse est de caractériser les altérations vasculaires survenant au moment de la PE et leurs conséquences à long terme sur les fonctions cognitives et de caractériser si les PROKs et les PROKRs peuvent constituer des cibles thérapeutiques pour un traitement préventif de la PE. Ces objectifs seront abordés par des études sur le modèle murin de la PE et sur les modèles cellulaires de la BHE. Les études seront réalisées en nous appuyant sur le savoir-faire de l’équipe MAB2 et sur la collaboration avec des experts des interfaces sang-cerveau, de l’IRM et des tests comportementaux. Afin de corréler nos résultats avec la clinique, des collaborations avec des cliniciens et hôpitaux, nous permettront d’avoir accès à des échantillons de sang et tissus de patientes ayant souffert de PE.
Auto-organisation des réseaux de microtubules cellulaires
Les microtubules produisent des forces mécaniques lorsqu'ils s'assemblent et désassemblent. Ils supportent également les forces produites par les moteurs moléculaires. La distribution spatiale de ces deux ensembles de forces oriente le transport intracellulaire, positionne les organites et détermine ainsi la compartimentation et la polarité cellulaires. L'architecture du réseau de microtubules dépend de deux contributions principales : la croissance programmée, qui est définie par la quantité et la localisation des nucléateurs de microtubules, et l'auto-organisation des microtubules et des moteurs, qui dépend de la concentration de divers moteurs et du nombre et de la longueur des microtubules. Cette contribution a été très étudiée dans le fuseau formé par les microtubules pendant la mitose, mais elle est relativement peu caractérisée dans l'interphase bien qu'elle soit au cœur de la plupart des fonctions cellulaires. Nous avons récemment réussi à définir des conditions de travail nous permettant de réduire la croissance prévue et de mettre en évidence l'auto-organisation des microtubules et des moteurs. A notre grande surprise, nous avons découvert que les composants pouvaient s'auto-organiser en de multiples domaines, contenant soit des moteurs dirigés par l'extrémité plus, soit par l'extrémité moins, séparés par des faisceaux de microtubules alignés.Nous proposons d'explorer davantage ces conditions et de définir le diagramme de phase définissant le nombre et la forme de ces domaines. Cette première partie servira de base à une étude plus approfondie de ce processus dans divers types de cellules et de leur évolution au fur et à mesure que les cellules évoluent d'un état de prolifération à un état d'indifférenciation (c'est-à-dire au fur et à mesure que l'auto-organisation progresse).
Effet des radiations ionisantes et utilisation de molécules radio-sensibilisantes dans un modèle murin de cancer du sein pertinent et modulable
Le programme proposé vise à évaluer l'efficacité de molécules améliorant les effets de la radiothérapie, dans des modèles in vitro et in vivo de cancer du sein.
D'une part, des nanoparticules bi-métalliques développées au laboratoire feront l'objet d'un test d'efficacité de radiopotentialisation, principalement dans un modèle murin immunocompétent. Un suivi clinique, histologique, et immunitaire des animaux et de leurs tumeurs permettra de confirmer l'intérêt de ces molécules pour une application thérapeutique en appui à la radiothérapie. De plus, ces nanoparticules innovantes ont été conçues comme biodosimètres, utilisant des propriétés physiques remarquables des nanoparticules métalliques. Le projet inclut également l'évaluation de ce potentiel de biodosimétrie, en collaboration étroite avec des équipes de physiciens du CEA qui ont développé des outils de détection.
D'autre part, des inhibiteurs spécifiques d'une protéine de réparation de l'ADN seront utilisés afin de bloquer les réparations suivant l'irradiation. Ainsi, les cellules cancéreuses endommagées seront dirigées vers une mort cellulaire, y compris les cellules contournant habituellement les dommages induits à l'ADN par la radiothérapie. L'objectif du programme de thèse est d'évaluer les effets de ces molécules sur des modèles cellulaires in vitro, et aussi dans des modèles murins.
Le programme proposé bénéficiera des collaborations du laboratoire avec des physiciens et des chimistes, et des installations expérimentales et plateformes de l'IRCM (irradiation, expérimentation animale, microscopie, cytométrie, etc...)
Caractérisation moléculaire et physiologique des voies de biosynthèse des sucres chez les macroalgues brunes
L’objectif de ce projet de thèse est de caractériser au niveau moléculaire et physiologique les voies de biosynthèse des sucres chez les macroalgues brunes. Ces dernières produisent deux principaux types de sucres de stockage, le mannitol (sucre simple) et la laminarine (polymère constitué majoritairement d’unités glucose avec occurrence optionnelle de quelques unités mannitol). Ces voies de biosynthèse étant très mal connues, ce projet de thèse a pour objectif principal d’identifier et caractériser les enzymes responsables des activités catalytiques de ces deux voies de biosynthèse interconnectées chez la macroalgue brune Ectocarpus. Des approches originales de biologie moléculaire et cellulaire, incluant l’édition de génome, permettront de générer du matériel biologique indispensable à la caractérisation de ces voies de biosynthèse et à leur rôle sur la physiologie des macroalgues brunes.