Implication des protéines paralogues de Rad51 dans la formation des filaments Rad51 lors de la réparation de l'ADN

La recombinaison homologue (RH) est un mécanisme majeur de réparation des cassures double-brin de l'ADN induites par les radiations ionisantes. Une étape clé de la RH est la formation de filaments nucléoprotéique Rad51 sur l'ADN simple brin généré par ces cassures. Nous avons montré qu'un contrôle strict de ces filaments est essentiel, afin que la RH n'induise pas elle-même des réarrangements chromosomiques (eLife 2018, Cells 2021). Chez l'homme, les homologues fonctionnels des protéines de contrôle sont des suppresseurs de tumeurs. Ainsi, le contrôle de la RH semble être aussi important que le mécanisme de la RH lui-même. Notre projet implique l'utilisation de nouveaux outils moléculaires permettant une véritable percée dans l'étude de ces contrôles. Nous utiliserons une version fonctionnelle fluorescente de la protéine Rad51 développée pour la première fois par nos collaborateurs A. Taddei (Institut Curie), R. Guérois et F. Ochsenbein (I2BC, Joliot, CEA). Cette avancée majeure nous permettra d'observer l'influence des protéines de contrôle sur la réparation de l'ADN par microscopie dans des cellules vivantes. Nous avons également développé des modèles structuraux très précis des mégacomplexes de protéines de contrôle en association avec les filaments Rad51. Cette étude a également conduit à l'identification de domaines spécifiques pour chaque protéine paralogue, en dehors du noyau structurellement conservé de type Rad51, qui pourraient définir la spécificité de chaque protéine paralogue. Nous utiliserons une approche multidisciplinaire basée sur la génétique, la biologie moléculaire, la biochimie, la structure des protéines et des méthodes de microscopie, et la levure comme organisme modèle pour étudier les conséquences de l'ablation de ces domaines spécifiques. Nous rechercherons également des protéines liant spécifiquement ces domaines. Leur identification sera cruciale pour comprendre la fonction des complexes paralogues de Rad51 et aideront à développer de nouvelles approches thérapeutiques.

Localisation et dynamique des protéines clés associées au nucléoïde au cours du remodelage du nucléoïde bactérien induit par le stress.

Le remodelage, et en particulier, la compaction de nucléoïdes, est un mécanisme commun de réponse au stress chez les bactéries, qui leur permet de réagir rapidement aux changements soudains de leur environnement. Par des approches de microscopie optique avancées, nous avons récemment suivi les changements de morphologie et de volume des nucléoïdes induits par l'exposition au rayonnement UV-C dans la bactérie radio-résistante, Deinococcus radiodurans. Ce processus en deux étapes implique une condensation initiale rapide du nucléoïde suivie d'une phase de décompaction plus lente pour restaurer la morphologie normale du nucléoïde, avant que la croissance et la division cellulaires ne puissent reprendre. Les protéines associées aux nucléoïdes (NAP) sont connues pour être des acteurs clés de ce processus, bien que les détails de leur implication restent encore peu décrits. Nous avons commencé à faire la lumière sur le rôle central de la principale NAP, la protéine HU, dans ce processus. Le projet de thèse que nous proposons prévoit d'étendre ce travail à 5 autres NAPs impliquées dans le processus de remodelage des nucléoïdes induit par le stress. Le/la doctorant(e) effectuera des études biochimiques pour suivre l'abondance de ces facteurs clés, de la microscopie de fluorescence pour cartographier leurs distributions et du suivi de particules uniques pour déterminer leurs dynamiques. Ces travaux nous permettront d'approfondir nos connaissances sur les processus fondamentaux qui régissent l'organisation du génome bactérien et comment ils sont affectés par le rayonnement UV et les dommages à l'ADN.

Effet des radiations ionisantes et utilisation de molécules radio-sensibilisantes dans un modèle murin de cancer du sein pertinent et modulable

Le programme proposé vise à évaluer l'efficacité de molécules améliorant les effets de la radiothérapie, dans des modèles in vitro et in vivo de cancer du sein.
D'une part, des nanoparticules bi-métalliques développées au laboratoire feront l'objet d'un test d'efficacité de radiopotentialisation, principalement dans un modèle murin immunocompétent. Un suivi clinique, histologique, et immunitaire des animaux et de leurs tumeurs permettra de confirmer l'intérêt de ces molécules pour une application thérapeutique en appui à la radiothérapie. De plus, ces nanoparticules innovantes ont été conçues comme biodosimètres, utilisant des propriétés physiques remarquables des nanoparticules métalliques. Le projet inclut également l'évaluation de ce potentiel de biodosimétrie, en collaboration étroite avec des équipes de physiciens du CEA qui ont développé des outils de détection.
D'autre part, des inhibiteurs spécifiques d'une protéine de réparation de l'ADN seront utilisés afin de bloquer les réparations suivant l'irradiation. Ainsi, les cellules cancéreuses endommagées seront dirigées vers une mort cellulaire, y compris les cellules contournant habituellement les dommages induits à l'ADN par la radiothérapie. L'objectif du programme de thèse est d'évaluer les effets de ces molécules sur des modèles cellulaires in vitro, et aussi dans des modèles murins.
Le programme proposé bénéficiera des collaborations du laboratoire avec des physiciens et des chimistes, et des installations expérimentales et plateformes de l'IRCM (irradiation, expérimentation animale, microscopie, cytométrie, etc...)

Influence du TEL dans la réponse biologique aux irradiations FLASH

Des études récentes avec des faisceaux d'électrons et de protons ont montré que l’irradiation à des débits de dose supérieurs à 40 Gy/s peut être aussi efficace pour inhiber la croissance tumorale que l'irradiation à la dose conventionnelle actuellement utilisée (typiquement 1 Gy/min) mais beaucoup moins toxique pour les tissus sains. Ce phénomène est connu sous le nom « d'effet FLASH ». Cet effet est considéré comme l'une des découvertes les plus importantes de l'histoire récente de la radiobiologie en raison de son potentiel d'amélioration de la fenêtre thérapeutique entre le contrôle tumoral et la toxicité tissulaire normale. Des études récentes montrent que les mécanismes biologiques de l’effet FLASH sont liés à l’oxygénation différentielle des tissus. Cependant, les mécanismes exacts des effets biologiques cellulaires des irradiations FLASH ne sont pas complètement clairs et certains sont même contradictoires.

L’objectif de ce projet est une caractérisation moléculaire de l’effet FLASH sur un système modèle parfaitement maîtrisé in vitro. Les irradiations FLASH de cellules cancéreuses et de cellules saines seront comparées à des irradiations à débit de dose conventionnel en utilisant des électrons et des ions carbones dans les deux laboratoires associés. L’effet différentiel sera rapporté au condition d’oxygénation des cellules, au métabolisme REDOX / mitochondrial et aux modifications générales du métabolisme cellulaire.

Réponse des Cellules Souches Spermatogoniales à une irradiation par les ions lourds : évaluation fonctionnelle et transcriptome chez la souris adulte.

Dans l'espace profond, les astronautes seront exposés au rayonnement cosmique galactique, dont les ions lourds de forte énergie, éléments minoritaires, sont très toxiques pour les cellules. Les conséquences sur l'organisme de ces expositions chroniques à faible dose restent mal connues faute de données chez l'homme. Afin d'évaluer l'impact d'un séjour prolongé dans l'espace sur la fertilité masculine, ce projet propose d'étudier les effets d'une irradiation par un faisceau d'ions 56Fe sur les cellules souches spermatogoniales (CSS) de souris. Chez l'adulte, la production continue de spermatozoïdes repose sur un stock de CSS pérennisé par autorenouvellement. L'intégrité de l'activité des CSS irradiées sera testée in vivo par des tests de transplantation. Différents paramètres des CSS irradiées seront analysés (lésions dans l'ADN, mortalité, cycle cellulaire...). Une signature transcriptionnelle et des marqueurs de l'exposition aux ions lourds seront recherchés dans les spermatogonies indifférenciées (single cell - RNA seq), et les réseaux géniques des réponses au stress seront particulièrement étudiés. L'ensemble de ces données pourra servir de base à l'étude du risque héréditaire et épigénétique lié à ces séjours spatiaux, mais également à l'amélioration des mesures de protection.

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