Implication des protéines paralogues de Rad51 dans la formation des filaments Rad51 lors de la réparation de l'ADN
La recombinaison homologue (RH) est un mécanisme majeur de réparation des cassures double-brin de l'ADN induites par les radiations ionisantes. Une étape clé de la RH est la formation de filaments nucléoprotéique Rad51 sur l'ADN simple brin généré par ces cassures. Nous avons montré qu'un contrôle strict de ces filaments est essentiel, afin que la RH n'induise pas elle-même des réarrangements chromosomiques (eLife 2018, Cells 2021). Chez l'homme, les homologues fonctionnels des protéines de contrôle sont des suppresseurs de tumeurs. Ainsi, le contrôle de la RH semble être aussi important que le mécanisme de la RH lui-même. Notre projet implique l'utilisation de nouveaux outils moléculaires permettant une véritable percée dans l'étude de ces contrôles. Nous utiliserons une version fonctionnelle fluorescente de la protéine Rad51 développée pour la première fois par nos collaborateurs A. Taddei (Institut Curie), R. Guérois et F. Ochsenbein (I2BC, Joliot, CEA). Cette avancée majeure nous permettra d'observer l'influence des protéines de contrôle sur la réparation de l'ADN par microscopie dans des cellules vivantes. Nous avons également développé des modèles structuraux très précis des mégacomplexes de protéines de contrôle en association avec les filaments Rad51. Cette étude a également conduit à l'identification de domaines spécifiques pour chaque protéine paralogue, en dehors du noyau structurellement conservé de type Rad51, qui pourraient définir la spécificité de chaque protéine paralogue. Nous utiliserons une approche multidisciplinaire basée sur la génétique, la biologie moléculaire, la biochimie, la structure des protéines et des méthodes de microscopie, et la levure comme organisme modèle pour étudier les conséquences de l'ablation de ces domaines spécifiques. Nous rechercherons également des protéines liant spécifiquement ces domaines. Leur identification sera cruciale pour comprendre la fonction des complexes paralogues de Rad51 et aideront à développer de nouvelles approches thérapeutiques.
Décryptage à résolution atomique du paysage énergétique complexe de la chaperone humaine HSP90 à l'aide d'outils de RMN et d'IA avancés.
HSP90 est une chaperonne humaine impliquée dans le repliement d'une grande variété de protéines clientes, y compris de nombreuses protéines oncogènes. Cette machinerie moléculaire complexe est connue pour avoir des réarrangements conformationnels massifs tout au long de son cycle fonctionnel. La cristallographie aux rayons X et la cryoEM ont fourni des structures instantanées à haute résolution de cette machine humaine en complexe avec des co-chaperones et des protéines clientes, mais n'ont pas réussi à fournir les informations cinétiques et résolues dans le temps nécessaires à une compréhension complète de son mécanisme. Nous prévoyons d'utiliser des expériences de RMN combinées à un nouvel outil d'analyse amélioré par l'IA pour obtenir une image détaillée du paysage énergétique de cette cible médicamenteuse importante. Ce projet permettra d'obtenir des informations structurales sur les différents états excités de HSP90 et la dynamique conformationnelle entre ces états. En collaboration avec l'industrie pharmaceutique, nous exploiterons cette nouvelle approche pour révéler comment les ligands peuvent moduler le paysage énergétique et la population des différents états fonctionnels. Ces informations seront particulièrement utiles pour la conception de nouveaux médicaments capables de bloquer la chaperone HSP90 dans un seul état, une étape importante vers le développement de médicaments plus spécifiques et plus efficaces.
Apport de l'intelligence artificielle (IA) pour comprendre les modes d'action des microARN, application au cancer
Les microARN ont une importance démontrée dans un grand nombre de processus de cancérogénèse allant de l’initiation, à la propagation et l’apparition de métastases. Ils suscitent de nombreux espoirs en tant que cibles de traitement thérapeutiques. Cependant, le candidat médicament MRX34 (qui mime un microARN) s’est avéré un échec chez les patients car trop toxique. Il est donc urgent de mieux comprendre le mode d’actions des microARN afin de concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Le projet de thèse propose d’utiliser deux technologies de pointes pour cela : les données de co-séquençage microARN / ARNm, à l’échelle de la cellule unique, et les techniques d’intelligence artificielle (IA, dont réseaux de neurones et XGBoost). Il bénéficiera de l’apport de deux autres projets qui s’achèvent en 2025 (biseau de quelques mois avec la thèse CFR) : une thèse financée par Pfizer-INSERM, et un projet multi-équipe financé par le plan cancer. Ces deux projets ont déjà permis une analyse statistique rigoureuse des données de co-séquençage à l’échelle de la cellule unique qui sera utilisée au cours de la thèse. Une collaboration, déjà initiée, est prévue avec le Gipsa-Lab, Grenoble, spécialiste d’apprentissage machine / IA.
Dynamique et désordre molèculaire dans la machinerie de réplication du virus SRAS CoV 2
La nucléoprotéine (N) du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) est essentielle à la réplication du génome, à l'encapsidation du génome viral et à la régulation de la transcription des gènes. Le domaine central désordonné est essentiel à la fonction de cette protéine hautement dynamique, contenant un certain nombre de mutations importantes qui sont responsables d'une meilleure activité virale, et comprenant une région qui est hyperphosphorylée pendant le cycle viral. La spectroscopie RMN est l'outil de choix pour étudier le comportement conformationnel des protéines intrinsèquement désordonnées, une classe abondante de protéines qui sont fonctionnelles sous leur forme désordonnée. Elles représentent 40 % du protéome et sont trop dynamiques pour être étudiées par cristallographie ou microscopie électronique. Le laboratoire hôte a développé un grand nombre d'outils uniques basés sur la RMN pour aider à comprendre la fonction de cette classe de protéines à une résolution atomique. Nous utiliserons la RMN, la RMN paramagnétique, la diffusion aux petits angles, le FRET à molécule unique et la microscopie électronique, en combinaison avec la simulation de la dynamique moléculaire, pour décrire les interactions de N avec les protéines partenaires virales et l'ARN viral. Les modifications post-traductionnelles, en particulier la phosphorylation, jouent un rôle fonctionnel important, qui reste mal compris. Nous étudierons l'impact de la phosphorylation sur la dynamique conformationnelle et établirons un lien avec les modifications de la fonction. Les résultats seront corrélés avec la microscopie optique et électronique, réalisée en collaboration.
Machinerie d'assemblage du site actif de l'hydrogénase à [FeFe]
Afin de répondre au problème de la crise climatique, l’humanité se doit de trouver rapidement des sources d’énergie renouvelables et décarbonées. Une solution prometteuse est l’utilisation du dihydrogène (H2), dont la production peut être réalisée grâce à des enzymes : les hydrogénases à [FeFe]. Ces dernières catalysent la réaction réversible d’oxydation du dihydrogène grâce à un site actif consistant en un complexe métallique désigné « H-cluster ». Sa biosynthèse est un processus complexe qui implique trois maturases : les protéines HydG, HydE et HydF. Même si ces dernières années, des progrès importants ont été réalisés, la compréhension complète de ce processus nous est encore inaccessible, du fait notamment de la complexité des réactions chimiques impliquées. C’est pour cette raison que nous souhaitons réaliser une étude structurale combinée à un suivi pas à pas de la réaction par spectroscopie pour identifier et caractériser les différents intermédiaires de la réaction d’une des enzymes clés du processus. Ce projet est une collaboration étroite entre deux équipes du CEA leaders dans l’étude des relations structure–fonction des métalloprotéines sensibles à l’oxygène. Le doctorant bénéficiera d’un environnement scientifique et technique idéale pour réaliser cet objectif, ceci étant particulièrement important dans la perspective du développement d’une économie de l’hydrogène.
Localisation et dynamique des protéines clés associées au nucléoïde au cours du remodelage du nucléoïde bactérien induit par le stress.
Le remodelage, et en particulier, la compaction de nucléoïdes, est un mécanisme commun de réponse au stress chez les bactéries, qui leur permet de réagir rapidement aux changements soudains de leur environnement. Par des approches de microscopie optique avancées, nous avons récemment suivi les changements de morphologie et de volume des nucléoïdes induits par l'exposition au rayonnement UV-C dans la bactérie radio-résistante, Deinococcus radiodurans. Ce processus en deux étapes implique une condensation initiale rapide du nucléoïde suivie d'une phase de décompaction plus lente pour restaurer la morphologie normale du nucléoïde, avant que la croissance et la division cellulaires ne puissent reprendre. Les protéines associées aux nucléoïdes (NAP) sont connues pour être des acteurs clés de ce processus, bien que les détails de leur implication restent encore peu décrits. Nous avons commencé à faire la lumière sur le rôle central de la principale NAP, la protéine HU, dans ce processus. Le projet de thèse que nous proposons prévoit d'étendre ce travail à 5 autres NAPs impliquées dans le processus de remodelage des nucléoïdes induit par le stress. Le/la doctorant(e) effectuera des études biochimiques pour suivre l'abondance de ces facteurs clés, de la microscopie de fluorescence pour cartographier leurs distributions et du suivi de particules uniques pour déterminer leurs dynamiques. Ces travaux nous permettront d'approfondir nos connaissances sur les processus fondamentaux qui régissent l'organisation du génome bactérien et comment ils sont affectés par le rayonnement UV et les dommages à l'ADN.
Rôle de la molécule signal ppGpp dans la résilience des plantes face au réchauffement climatique
Dans le contexte des défis croissants liés au changement climatique, les cultures sont menacées par l'augmentation des températures et les sécheresses prolongées, entraînant une baisse de l'efficacité photosynthétique et la nécessité d'une acclimatation rapide au stress. Dans ce projet de doctorat, nous étudierons le rôle de la voie de signalisation du nucléotide guanosine tétraphosphate (ppGpp), un régulateur reconnu de la fonction des plastes et de la photosynthèse. Des travaux préliminaires récents de notre laboratoire et d'autres suggèrent que le ppGpp joue un rôle central dans l'acclimatation des plantes au stress. Nous avons des indications que la perturbation de la signalisation ppGpp affecte les réponses des plantes au stress thermique. Cette recherche vise à explorer comment le ppGpp intervient dans l'acclimatation des plantes aux stress thermique et hydrique. En utilisant une combinaison d'évaluations physiologiques, de techniques biochimiques, de transcriptomique et de biosenseurs, cette étude examinera la modulation des niveaux de ppGpp dans des conditions de stress, son impact sur l'expression du génome plastidial, et ses interactions avec d'autres voies de signalisation. L'objectif ultime est d'améliorer notre compréhension du rôle du ppGpp dans l'acclimatation des plantes, offrant des perspectives pour améliorer la résilience des cultures dans un monde confronté au changement climatique.
Les protéines de type prion dans le plancton marin: à la recherche de nouveaux facteurs moléculaires de l’adaptation aux changements de température
Le changement climatique remodèle la répartition des espèces sur la planète et les mécanismes d’adaptation au stress thermique sont alors sollicité. Récemment, chez les plantes terrestres le rôle des protéines de type prion a été mis en évidence dans les mécanismes de floraison et de vernalisation. Ces protéines atypiques n’ont cependant pas été recherché dans le monde marin où le plancton joue un rôle essentiel dans la pompe à carbone biologique et le réseau trophique marin. Pour explorer le monde des protéines de type prion et leur rôle dans l'adaptation aux changement de température des espèces planctoniques marines, nous proposons un programme de doctorat de trois ans au sein de l'équipe de biologie computationnelle du CEA-SEPIA à l'Institut de biologie François Jacob situé à Fontenay-aux-Roses, France. Le premier objectif est d'identifier et de caractériser la fonction des protéines marines de type prion ainsi que leur biogéographie dans les océans du monde. Le doctorant reconstruira également l'évolution moléculaire de ces protéines à travers un large spectre d'espèces de plancton marin grâce à des analyses de gain/perte de gènes et de signaux d'adaptation moléculaire. L'approche de recherche s'appuiera sur la génomique et la phylogénie comparatives à partir des données métagénomiques et métatranscriptomiques de Tara Oceans. De plus, l'étudiant identifiera des protéines de type prion impliquées dans l'adaptation aux changements de température en intégrant les données spatiales et environnementales collectées par les expéditions Tara Oceans. Dans un contexte du changement climatique actuel, cette recherche s’intègre dans la compréhension de l’évolution moléculaire des protéines de type prion, éclairant leur rôle dans l’adaptation d’espèces jouant un rôle clé dans les écosystèmes marins.
Répartition des métaux dans la calcite à base de coccolithes et applications biotechnologiques des matériaux coccolithiques dopés aux métaux
Malgré les cultures établies de microalgues coccolithophores et la production à grande échelle de biominéraux de coccolithes (quantités de grammes de calcite minérale à partir de litres de culture), le coccolithe en tant que matériau fonctionnel avancé a peu progressé dans le domaine des bionanotechnologies. Ce projet décrira quantitativement le dopage métallique dans et à la surface de la calcite à base de coccolithes pour plusieurs métaux de transition, éléments du groupe principal et lanthanides. L'élucidation du potentiel du coccolithophore à incorporer des ions métalliques dans/à la production de calcite biogénique ne révèlera pas seulement les possibilités biotechnologiques des matériaux coccolithiques, mais offrira également un aperçu du rôle des métaux dans le processus de biominéralisation et l'effet de criblage biologique. Les matériaux coccolithiques dopés aux métaux feront l'objet d'une caractérisation physique et chimique (l'accent étant mis sur les métaux stratégiques dont l'incorporation dans la calcite biogène a été améliorée ou qui peuvent être remplacés/déposés à la surface des coccoltihs). Les candidats coccolithes dopés aux métaux seront sélectionnés en vue d'une application biotechnologique sur la base de leurs propriétés physiques et optiques (par exemple, activité catalytique pour les métaux de transition et photoluminescence pour les lanthanides).
PPARy, un acteur majeur de l'homéostasie du stroma médullaire et une cible thérapeutique pour la myélofibrose ?
La myélofibrose (MF) est la plus grave des néoplasies myéloprolifératives (NMP) Philadelphie négative avec une médiane de survie de 5-6 ans. Qu'elle soit diagnostiquée de novo (MyéloFibrose Primitive, PMF) ou qu'elle apparaisse secondairement à une autre NMP, les caractéristiques de la MF sont semblables. Une sous-population de cellules hématopoïétiques issues du clone pathologique libère dans le microenvironnement médullaire des cytokines pro-inflammatoires et des facteurs de croissance. En réponse, le microenvironnement médullaire va subir un remodelage engendrant une ostéosclérose ainsi qu'une fibrose des cellules stromales mésenchymateuses (MSC) associée à une perte du soutien hématopoïétique. La classification OMS de 2016 intègre un état de prémyélofibrose favorisant le diagnostic précoce des patients présentant un risque accru d'évolution. Toutefois, si des progrès majeurs ont été réalisés sur la pathogénèse de la maladie, avec notamment la description des mutations dites « drivers » responsables de la myéloprolifération (JAK2, CALR et MPL), en dehors de l'allogreffe de cellules souches hématopoïétiques qui ne concerne qu'une minorité de patients, les traitements actuels sont principalement symptomatiques et ont peu d'influence sur l'histoire naturelle de la MF.
Récemment, nous avons démontré que l'activation du récepteur nucléaire PPARy (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-gamma) par ses ligands pharmacologiques (Actos®) ou (Pentaza®) permettait de réduire le développement de l'ostéosclérose, de la fibrose réticulinique de la moelle osseuse (MO) et de prévenir l'anémie conséquente au remodelage médullaire dans trois modèles précliniques murins de la MF (Lambert, Saliba et al. 2021). Ces résultats positionnent les agonistes de PPARy comme des candidats thérapeutiques intéressants. Cependant, avant d'envisager leur repositionnement thérapeutique dans la prise en charge de la MF, il est impératif de caractériser le statut et la fonction de PPARy au sein des MSC médullaires tant au stade physiologique que lors du développement des NMP.
Dans ce projet, nos premiers résultats montrent que l'expression de PPARy est diminuée dans les MSC murines et humaines au stade de MF. En revanche aucune modification de l'expression de PPARy n'est observée dans les MSC issues des autres NMP. Les analyses transcriptomiques démontrent également que le TGF-B, une cytokine majeure du développement de la MF, est capable de réguler négativement l'expression de PPARy dans les MSC. Afin de mimer ce défaut d'expression, nous avons invalidé PPAR-y (KO) dans deux lignées de MSC médullaires, la première murine (MS5), la seconde humaine (HS5, en cours de caractérisation). Dans ces conditions, l'expression basale d'un panel de gènes associés à la MF est augmenté dans les MSC-KO au niveau de celle des lignées sauvages stimulées par le TGF-B. L'expression de ce panel est encore augmentée dans les MSC-KO en présence de TGF-B, indiquant une potentialisation du signal médié par le TGF-B en l'absence de PPARy. Cette signature transcriptomique associée aux MSC-KO est retrouvée dans les MSC murines issues du modèle de MF induite par la thrombopoïétine (TPOhigh) ainsi que dans les MSC humaines en provenance de patients présentant une PMF. En revanche ce profil d'expression n'est pas retrouvé dans les MSC de patients présentant une autre NMP, indiquant qu'il signe bien un stade de MF.
L'invalidation de PPARy n'affecte pas la signature phénotypique des MSC médullaires, toutefois leur caractère multipotent est altéré avec une perte de la capacité de différentiation adipocytaire associée à une augmentation du potentiel de différentiation ostéo-chondrocytaire. Ces observations histologiques sont corroborées par la diminution de la production des facteurs adipocytaires par les MSC-KO et une augmentation de l'expression du facteur ostéoblastique Runx-2. De plus, le surnageant de la lignée KO présente une forte augmentation de l'ostéoprotégérine (OPG), molécule soluble produite par les ostéoblastes qui entraine l'apoptose des ostéoclastes. Cette dérégulation de la balance ostéoblaste/ostéoclaste en condition KO pourrait rendre compte de l'ostéosclérose observée chez les patients présentant une MF. De plus, les productions de CXCL12 (CXC motif Chemokine Ligand 12) et le facteur de croissance médullaire SCF (c-kit ligand) sont fortement diminués en condition MSC-KO, tant au niveau transcriptomique que protéique. Ces données récapitulent les résultats décrits lors des analyses transcriptomiques des MSC de patients présentant une fibrose. Parallèlement, la capacité des MSC-KO à soutenir l'hématopoïèse, à court et long terme, est significativement diminuée reflétant les cytopénies associées à la MF.
In silico, des analyses de RNA-Seq ont été réalisées sur les lignées MS5-WT et MS5-KO. Les premières analyses d'enrichissement d'ensembles de gènes (GSEA) montrent que les voies les plus significativement affectées concernent l'inflammation, la myogénèse (transition MSC vers myofibroblaste) et le cycle cellulaire. Des analyses complètes doivent maintenant être réalisées pour mettre en évidence de nouveaux gènes candidats thérapeutiques et mieux comprendre le développement de la fibrose médullaire.
Ces premiers résultats in vitro, soutiennent le rôle clé du récepteur PPARy dans l’homéostasie du microenvironnement médullaire et dans la genèse de son remodelage lors du développement de la myélofibrose. Toutefois, les approches in vitro ne peuvent pas à elles seules récapituler toute la complexité d’une pathologie impliquant de multiples intervenants comprenant les cellules hématopoïétiques, immunologiques et l’ensemble des types cellulaires composants le microenvironnement médullaire. Pour intégrer tous ces paramètres nous avons établi un modèle murin ou l’expression de PPARy est réduite (haplo-insuffisance) ou invalidée (KO) dans les MSC médullaires des animaux. C’est l’étude de ce modèle qui constituera le cœur du projet. Il permettra dans un premier temps, in vivo :
1) De caractériser le rôle de PPARy dans l’homéostasie du microenvironnement médullaire.
2) D’évaluer l’impact de la diminution de son expression sur le développement de la fibrose médullaire.
3) De valider le positionnement de PPARy comme cible thérapeutique dans la prise en charge de la fibrose médullaire et d’envisager le repositionnement de ses agonistes pharmacologiques (Actos® ; (Pentaza®) dans cette pathologie.
La présence d’une pré-fibrose/fibrose médullaire est un facteur de mauvais pronostic dans les NMP ou les leucémies aiguës myéloïdes (LAM). Cependant il est difficile de déterminer si cet état constitue simplement un marqueur ou s’il a un rôle actif dans le développement des hémopathies. L’utilisation de ces modèles (Haplo-insuffisants ou KO pour PPARy dans les MSC) en association avec les modèles précliniques murins de NMP (LMC (BCR-ABL) ; Polyglobulie de Vaquez (JAK2 V617F), Thrombocytémie essentielle (CALRDel52)) permettra de déterminer dans un second temps si :
1) La présence d’une prédisposition à la fibrose médullaire influe sur l’histoire naturelle des hémopathies.
2) Dans ces pathologies qui sont à l’origine purement hématopoïétiques (mutation de la cellule souche hématopoïétique), il est pertinent d’associer au traitement ciblant le clone malin un traitement visant à prévenir le développement de la fibrose médullaire (activation du récepteur PPARy par ses ligands dans la condition d’haplo-insuffisance).
L’ensemble de ce projet se place dans le cadre des biotechnologies de demain (F), visant à améliorer la prise en charge des patients en développant une médecine personnalisée.