Thérapie génique par trans-splicing pour la maladie de Stargardt : construction d’outils moléculaires et cellulaires pour cibler les mutations du gène ABCA4
Ce projet vise à développer une approche thérapeutique innovante pour la maladie de Stargardt, une dégénérescence maculaire causée par des mutations du gène ABCA4. La stratégie repose sur l’utilisation de la technologie SMaRT (Spliceosome-Mediated RNA Trans-splicing), qui permet de corriger les mutations au niveau du transcriptome en remplaçant les exons mutés de l’ARNm endogène par épissage en trans avec un ARN exogène (PTM). Les PTM ne contenant qu’une partie de l’ARNm à corriger, cette approche permettra de surmonter l’obstacle posé par la taille de l’ADNc ABCA4 qui dépasse la capacité d’emport de l’AAV. Le projet inclut plusieurs étapes faisant appel à des techniques de biologie moléculaire et cellulaire : construction de vecteurs pour exprimer les PTM, production de lignées cellulaires pour tester l'efficacité de domaines de liaison (BD) permettant l’épissage en trans et, criblage des BD pour l’optimisation des PTM. Les PTM sélectionnés seront ensuite testés dans des modèles d’organoïdes rétiniens et des modèles animaux pour démontrer leur potentiel thérapeutique pour traiter cette maladie génétique. L’AAV étant actuellement le vecteur le plus efficace pour transduire la rétine, ce projet ouvrira des nouvelles perspectives thérapeutiques pour la maladie de Stargardt.
DÉFENSOMES, CONTRE-DÉFENSOMES ET REMODELAGE DES COMMUNAUTÉS MICROBIENNES
Le transfert horizontal de gènes (HGT) permet aux bactéries de s'adapter rapidement à de nouveaux niches écologiques et défis. Ce processus est principalement facilité par les éléments génétiques mobiles (MGE), tels que les bactériophages (phages), les plasmides et les éléments transposables, qui sont présents dans la plupart des génomes, souvent en multiples copies. Le potentiel de conflits découlant des interactions entre les MGE et les bactéries a conduit à l'évolution de mécanismes de défense sophistiqués visant à filtrer, apprivoiser ou inactiver ces éléments. Parmi les exemples bien étudiés d'immunité anti-MGE figurent les systèmes de restriction-modification (R-M), l'infection abortive et les systèmes CRISPR-Cas. Ensemble, ces systèmes ont révolutionné le domaine de l'ingénierie génomique en tant qu'outils de clivage, de stabilisation et d'édition précis, et ont poussé la quête de nouveaux mécanismes de défense ainsi que de stratégies de contre-défense contre les MGE, capables de limiter leur action.
La dernière décennie a vu l'identification et, dans certains cas, la caractérisation mécanistique d'un arsenal étendu de systèmes de défense anti-MGE jusqu'alors inconnus. Ces systèmes peuvent être déployés à différentes étapes du processus d'infection par les MGE, soit en dégradant les acides nucléiques envahissants, en inhibant leur réplication, ou en induisant la dormance ou la mort des cellules infectées pour stopper la propagation de l'élément mobile à travers la population microbienne. Avec le nombre croissant de familles de défensomes identifiées, une découverte parallèle a été celle des systèmes de contre-défense codés par les MGE. Ces contre-défensomes déploient de multiples mécanismes pour inactiver les systèmes immunitaires de l'hôte (au-delà des mutations génétiques des bactériophages), incluant la liaison directe aux protéines immunitaires, la modification post-traductionnelle des protéines immunitaires, la ciblage des messagers secondaires et la contreaction des systèmes de défense épuisant des métabolites.
Beaucoup des systèmes de défense et de contre-défense connus à ce jour ont été découverts grâce à l'exploration bioinformatique des bases de données génomiques de référence (par exemple, NCBI RefSeq). Cependant, celles-ci surreprésentent des organismes qui peuvent être cultivés en laboratoire, offrant ainsi une vue limitée de la fraction inconnue de la diversité microbienne environnementale qui reste non cultivée. Afin de caractériser cette diversité cachée, nous avons récemment effectué un criblage à grande échelle de génomes de populations bactériennes de haute qualité, reconstruits à partir de métagénomes environnementaux, mettant en évidence la diversité des défensomes et le potentiel de coopération fonctionnelle ainsi que la génération de nouvelles fonctions entre différents modules défensifs [1]. Les résultats de cette étude ont soulevé des questions supplémentaires relatives à la nature des conflits et alliances entre les familles de systèmes de défense, l'étendue des stratégies de contre-défense dans le phagome environnemental, ainsi que la perspective de prioriser les gènes de défense 'core' pour le développement d'antimicrobiens capables de cibler une espèce bactérienne entière. Nous proposons d'aborder ces questions dans la proposition actuelle comme suit:
1) Premièrement, l'analyse de la co-occurrence / co-localisation des systèmes de défense et de l'immunité synergique à travers les espèces bactériennes et les biomes ;
2) Deuxièmement, une cartographie à grande échelle du contre-défensome des phagomes à travers plusieurs environnements ;
3) Troisièmement, l'analyse du 'core'-défensome à travers les espèces bactériennes, avec une validation supplémentaire du concept selon lequel ces gènes (dont beaucoup sont maintenant connus pour être essentiels) peuvent être utilisés comme cibles pour le développement d'antimicrobiens visant à éliminer une espèce bactérienne entière.
Mutagénèse et sélection de catalyseurs enzymatiques pour des applications biotechnologiques : développement d’une méthode intégrée in vivo
La biocatalyse, c’est-à-dire l’utilisation d’enzymes en chimie de synthèse, offre un large éventail de solutions « vertes » pour de nombreuses conversions. Les avantages des catalyseurs enzymatiques sont multiples : les enzymes élargissent les possibilités de synthèse à des transformations non accessibles par les procédés de chimie conventionnelle, la catalyse est le plus souvent asymétrique et réalisée dans des conditions douces réduisant risques, coûts et pollutions. Pour atteindre le plein potentiel de la biocatalyse, il est nécessaire de diversifier la spécificité de substrat des enzymes natives et améliorer leur vitesse de réaction sur des composés non-naturels. Des approches complémentaires sont activement développées, allant de la recherche de nouveaux catalyseurs dans la biodiversité accessible dans les banques de données génomiques aux méthodes de mutagénèse aléatoires ou dirigées et de détection à haut débit des activités enzymatiques. Lorsque l’activité enzymatique confère un avantage de croissance aux cellules-hôtes, la sélection in vivo dans un contexte génétique approprié permet de cribler de très larges banques de variantes des enzymes cibles.
A l’interface entre génétique moléculaire et biocatalyse pour la synthèse de composés chimiques d’intérêt, l’objectif du projet de thèse est d’installer dans le chromosome de l’organisme modèle Escherichia coli un système de mutagénèse in vivo faisant appel à des éditeurs de bases couplés à la RNA polymérase du phage T7 dont l’activité sera dirigée sur le gène d’intérêt choisi. Une fois validée, la méthode sera appliquée à l’évolution d’enzymes de type déshydrogénase, déjà activement étudiées dans le laboratoire, pour la sélection de variantes efficaces pour des conversions chimiques d’intérêt industriel.
Le/la doctorant.e pourra acquérir une expertise en génétique moléculaire, biologie synthétique, évolution dirigée in vivo et en biocatalyse appliquée à la synthèse organique et bénéficiera de l’environnement multidisciplinaire de l’UMR Génomique Métabolique.
Elucidation de la voie de dégradation de l’homarine dans les océans
Contexte :
La production biologique primaire dans les océans exerce un contrôle important sur le CO2 atmosphérique. Le phytoplancton transforme chaque jour 100 millions de tonnes de CO2 en des milliers de composés organiques différents (1). La majeure partie de ces molécules(sous forme de métabolites) est biologiquement labile et retransformée en CO2 en l'espace de quelques heures ou de quelques jours. Les boucles de rétroaction climat-carbone médiées par ce réservoir de carbone organique dissous (COD) labile dépendent de ce réseau de microbes et de métabolites. En d’autres termes, la résilience de l'océan face aux changements planétaires (comme l’augmentation de la température et l’acidification) dépendra de la façon dont ce réseau réagit à ces perturbations.
En raison de sa courte durée de vie, ce pool de COD labile est difficilement observable. Ces métabolites microbiens constituent pourtant les voies les plus importantes dans l'océan du transport du carbone et sont assimilés par les bactéries marines comme sources de carbone et d’énergie. La connaissance des principales voies métaboliques (des gènes aux métabolites) est donc nécessaire pour modéliser les flux de carbone dans les océans. Pourtant, la diversité de ces molécules reste largement inexplorée et nombre d’entre elles n'ont pas de voies biosynthétique et/ou catabolique annotées. C’est le cas de l'homarine (N-méthylpicolinate), un composé abondant dans les océans. La teneur en homarine peut atteindre 400 mM chez la cyanobactérie marine Synechococchus (2) et cet organisme ubiquitaire contribue entre 10 et 20 % de la production primaire nette mondiale (3). L’homarine, par son abondance, est probablement un métabolite important dans le cycle du carbone.
Projet :
Dans ce projet de thèse, nous voulons élucider la voie de dégradation de l’homarine dans les océans.
Ruegeria pomeroyi DSS-3 est une bactérie aérobie à Gram négatif, membre du clade marin Roseobacter. Ses proches parents représentent environ 10-20 % du plancton bactérien de la couche mixte côtière et océanique (4). En laboratoire DSS-3 peut utiliser l'homarine comme seule source de carbone, mais on ne dispose à ce jour d’aucune information sur les gènes et les catabolites impliqués dans ce processus.
L'analyse comparative d’expériences de RNAseq menées sur des cultures de DSS-3 cultivées avec de l'homarine ou du glucose (contrôle)comme source de carbone permettra de repérer les gènes candidats impliqués dans la voie de dégradation. En parallèle, cette voie sera étudiée via une approche métabolomique par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à très haute résolution. La différence de profil entre des métabolomes de DSS-3 provenant de cellules cultivées sur glucose comme source de carbone et ceux issus de cellules cultivées sur homarine aidera à détecter les catabolites de la voie. Enfin, les gènes candidats seront clonés pour une expression recombinante dans E. coli, les protéines correspondantes purifiées et leur activité caractérisée afin de reconstruire l'ensemble de la voie de dégradation de l'homarine in vitro.
L’analyse de l’expression de ces gènes dans les données du projet Tara Océans (5) sera la première étape pour mieux comprendre le rôle
de l'homarine dans le cycle du carbone.
Références :
(1) doi.org/10.1038/358741a0
(2) doi.org/10.1128/mSystems.01334-20
(3) doi.org/10.1073/pnas.1307701110
(4) doi.10.1038/nature03170
(5) https://fondationtaraocean.org/expedition/tara-oceans/
Vers une usine cellulaire produisant des biohydrocarbures : biologie et biotechnologie d'un modèle émergent de microalgue streptophyte
Dans l'histoire évolutive du vivant, l'adaptation progressive de certaines microalgues aquatiques à un mode de vie aéroterrestre a été une période capitale car elle a permis de donner naissance à toutes les plantes terrestres actuelles. Le séquençage récent de génomes d’algues streptophytes, un groupe jusqu’à présent peu étudié, a commencé à lever le voile sur ce processus évolutif. L’apparition chez une algue streptophyte ancestrale de la capacité à synthétiser et excréter des composés hydrophobes comme les hydrocarbures, capables de former une couche protectrice imperméable à l’eau à la surface des cellules, a nécessairement été une étape importante dans la survie et l’adaptation en milieu aérien. Aujourd’hui, l’incapacité des algues industrielles à excréter des hydrocarbures est par ailleurs un verrou biotechnologique important en vue d’une production dans un organisme photosynthétique d’hydrocarbures biosourcés pour la chimie verte ou les carburants. L’objectif de ce projet de thèse est donc double : d’abord, dans un but de connaissance fondamentale, de caractériser les voies de synthèse et d’excrétion de composés hydrophobes dans une algue qui est un modèle émergent d’algue streptophyte (et est jusqu’à présent la seule où l’on peut identifier un équipement enzymatique de synthèse d’hydrocarbures similaire à celui des plantes); ensuite, dans un but appliqué, de déterminer par des approches d’ingénierie génétique un set de protéines qui permet de maximiser la synthèse et l’excrétion des hydrocarbures dans cette algue modèle.
Élucider le mécanisme de la fixation enzymatique du carbone
Le groupe Synchrotron de l'Institut de Biologie Structurale de Grenoble développe actuellement une méthode innovante appelée TR-FOX (Time-Resolved Functional Oscillation Crystallography). Cette technique vise à élucider, d’une part, la dynamique globale des macromolécules biologiques en fonctionnement, et d’autre part, les détails de leur mécanisme catalytique. Elle repose sur l’utilisation d’un injecteur capable de déposer sur l’échantillon cristallin, durant l'enregistrement des données de diffraction, une gouttelette de quelques nanolitres contenant les substrat et cofacteur de la réaction étudiée. Cela déclenche ainsi une réaction enzymatique au sein du cristal. Cette approche peut être couplée à la spectroscopie d'absorption UV-Visible pour caractériser plus précisément la cinétique de la réaction. L'objectif est d'obtenir une série de structures représentant différents états du cycle catalytique, permettant ainsi la réalisation d’un film moléculaire du fonctionnement de l’enzyme. Cette thèse poursuit un double objectif : (i) Améliorer et valider la méthode TR-FOX, (ii) Élucider le mécanisme catalytique de deux enzymes impliquées dans la fixation du carbone soit par capture soit par conversion du CO2.
Vers une meilleure compréhension des protéines membranaires grâce à l’IA
Malgré les avancées spectaculaires de l'intelligence artificielle (IA), notamment avec des outils tels qu’AlphaFold, la prédiction des structures des protéines membranaires demeure un défi majeur en biologie structurale. Ces protéines, qui représentent 30% du protéome et 60% des cibles thérapeutiques, sont encore largement sous-représentées dans la Protein Data Bank (PDB), avec seulement 3% de structures résolues. Cette rareté s’explique par la difficulté à maintenir leur état natif dans un environnement amphiphile, ce qui complique leur étude, notamment avec les techniques structurales classiques.
Ce projet de thèse a pour objectif de lever ces obstacles en combinant les capacités prédictives d'AlphaFold avec des données expérimentales de diffusion aux petits angles (SAXS/SANS), obtenues en condition physiologique. L’étude se concentrera sur la protéine translocatrice TSPO, un marqueur clé en neuro-imagerie de plusieurs pathologies graves (cancers, maladies neurodégénératives) en raison de sa forte affinité pour divers ligands pharmacologiques.
Ce travail s’articulera autour de la prédiction de la structure de TSPO en présence et en absence de ligands, de l’acquisition de données SAXS/SANS du complexe TSPO/amphiphiles et de l’affinement des modèles grâce à des outils de modélisation avancée (MolPlay, Chai-1) et des simulations de dynamique moléculaire. En approfondissant la compréhension de la structure et de la fonction de TSPO, ce projet pourrait conduire à la conception de nouveaux ligands pour le diagnostic et la thérapie.
Effet de la combinaison des radiations ionisantes et de molécules radio-sensibilisantes dans des modèles de cancer du sein
Le programme proposé vise à évaluer l'efficacité de molécules améliorant les effets de la radiothérapie, dans des modèles in vitro et in vivo de cancer du sein. Deux types de molécules, à savoir un inhibiteur de la maintenance du génome mitochondrial et un inhibiteur de la voie du Base Excision Repair feront l'objet d'un test d'efficacité de radiopotentialisation dans les modèles.
Les inhibiteurs pressentis, qu’ils ciblent la maintenance du génome mitochondrial ou la voie du BER, font déjà l’objet de recherches in vitro, au sein du laboratoire et chez des collaborateurs. Nous avons montré que l’inhibition des mécanismes étudiés permet une diminution de la réparation des cassures de l’ADN suivant un stress génotoxique. Durant ce projet, nous évaluerons les effets des inhibiteurs sur les réparations des dommages à l’ADN induits par les irradiations de différents types (conventionnelle, ultra haut débit de dose, voire débit de dose extrême), ainsi que les mécanismes associés.
Une variabilité de réponse aux combinaisons thérapeutiques est très fréquemment observée lors du passage des modèles in vitro aux modèles in vivo. Ainsi nous évaluerons les inhibiteurs d’une part sur des modèles de lignées cellulaires bien caractérisés au laboratoire, et correspondant à différents sous-types de cancer du sein. D’autre part, les études seront complétées par une validation des effets relevés in vitro sur un modèle murin de cancer du sein. Ce modèle de xénogreffes, développé dans des animaux immunocompétents, permet un suivi clinique, histologique, et immunitaire des animaux et de leurs tumeurs afin de confirmer l'intérêt des molécules pour une application thérapeutique en appui à la radiothérapie.
Ce programme bénéficiera des collaborations du laboratoire avec des physiciens et des chimistes, et des installations expérimentales et plateformes de l'IRCM (irradiation, expérimentation animale, microscopie, cytométrie, etc...)
Dimensionnement du cytosquelette en relation avec la taille et la fonction des cellules
Chaque type cellulaire, défini notamment par sa fonction, se caractérise par une gamme de taille qui lui est spécifique. En effet, la taille des cellules au sein d'un type cellulaire donné présente une distribution étroite qui peut varier de plusieurs ordres de grandeur entre les cellules les plus petites, telles que les globules rouges, et les plus grandes comme les cellules musculaires. Cette caractéristique de taille est essentiellement maintenue au cours de la vie d'un individu et demeure très conservée chez les mammifères. L’ensemble de ces caractéristiques suggère donc que le maintien d'une « taille appropriée » pour une cellule donnée pourrait jouer un rôle important dans l'accomplissement de ses fonctions.
Le cytosquelette d'actine, qui comprend différentes architectures intracellulaires stables et dynamiques, joue un rôle majeur dans la plasticité structurale des cellules en réponse à des changements de forme ou de taille. Nos travaux récents suggèrent que les réseaux d'actine développés à l'intérieur d'une cellule s'adaptent à la taille et au volume de la cellule lorsque ces derniers varient. Cependant, la compréhension du mécanisme par lequel les cellules adaptent le taux de renouvellement et l'organisation de leurs nombreuses structures en compétition pour un même pool de monomères d’actine demeure incomplète.
Dans ce projet, nous proposons donc d'étudier l'organisation et la dynamique des réseaux d'actine au sein de types de cellules présentant des différences de taille et de fonction fondamentales. En particulier, notre étude se concentrera sur la caractérisation de l'impact de l'organisation/dynamique de ces réseaux sur différentes fonctions cellulaires telles que la migration cellulaire ou la polarisation. La rétroaction entre la dynamique de l'architecture du cytosquelette, la taille et la fonction de la cellule sera également abordée en imposant des perturbations dans l’organisation du cytosquelette.
Développement d’un système dosimétrique pour le suivi des traces alpha dans les essais in vitro de la radiothérapie interne vectorisée alpha
La thérapie alpha ciblée (TAC) est une nouvelle méthode prometteuse pour traiter le cancer. Elle utilise des substances radioactives appelées radioisotopes émetteurs alpha, qui sont injectées dans le corps du patient. Ces substances se dirigent spécifiquement vers les cellules cancéreuses, ce qui permet de concentrer la radiation là où elle est le plus nécessaire, c'est-à-dire près des tumeurs. Les particules alpha sont particulièrement efficaces car elles ont une courte portée et peuvent détruire les cellules cancéreuses de manière très ciblée.
Comme pour tout nouveau traitement, la TAC doit passer par des études précliniques pour vérifier son efficacité et la comparer à d'autres traitements existants. Une partie importante de ces recherches se fait en laboratoire, où des cellules cancéreuses sont exposées à ces substances radioactives pour observer leurs effets, comme le taux de survie des cellules. Cependant, évaluer l'impact des particules alpha nécessite des méthodes spécifiques, car leur comportement es