Développement d’un système dosimétrique pour le suivi des traces alpha dans les essais in vitro de la radiothérapie interne vectorisée alpha
La thérapie alpha ciblée (TAC) est une nouvelle méthode prometteuse pour traiter le cancer. Elle utilise des substances radioactives appelées radioisotopes émetteurs alpha, qui sont injectées dans le corps du patient. Ces substances se dirigent spécifiquement vers les cellules cancéreuses, ce qui permet de concentrer la radiation là où elle est le plus nécessaire, c'est-à-dire près des tumeurs. Les particules alpha sont particulièrement efficaces car elles ont une courte portée et peuvent détruire les cellules cancéreuses de manière très ciblée.
Comme pour tout nouveau traitement, la TAC doit passer par des études précliniques pour vérifier son efficacité et la comparer à d'autres traitements existants. Une partie importante de ces recherches se fait en laboratoire, où des cellules cancéreuses sont exposées à ces substances radioactives pour observer leurs effets, comme le taux de survie des cellules. Cependant, évaluer l'impact des particules alpha nécessite des méthodes spécifiques, car leur comportement es
Dynamique des protéines associées aux filaments nucléoprotéiques Rad51 - Implication dans la régulation de la recombinaison homologue
La recombinaison homologue (RH) est un mécanisme majeur de réparation des cassures double-brin de l'ADN induites par les radiations ionisantes. Une étape clé de la RH est la formation de filaments nucléoprotéique Rad51 sur l'ADN simple brin généré par ces cassures. Nous avons été les premiers a montré chez la levure qu'un contrôle strict de ces filaments est essentiel afin que la RH n'induise pas elle-même de réarrangements chromosomiques (eLife 2018, Cells 2021). Chez l'homme, les homologues fonctionnels des protéines de contrôle sont des suppresseurs de tumeurs. Ainsi, le contrôle de la RH semble être aussi important que le mécanisme de la RH lui-même. Notre projet implique l'utilisation de nouveaux outils moléculaires permettant une percée dans l'étude de ces contrôles. Nous utiliserons une version fonctionnelle fluorescente de la protéine Rad51 développée pour la première fois par nos collaborateurs A. Taddei (Institut Curie), R. Guérois et F. Ochsenbein (I2BC, Joliot, CEA). Cette avancée majeure nous permettra d'observer l'influence des protéines de contrôle sur la réparation de l'ADN par microscopie dans des cellules vivantes. Nous avons également développé des modèles structuraux très précis des complexes de protéines de contrôle en association avec les filaments Rad51. Nous recourrons à une approche multidisciplinaire basée sur la génétique, la biologie moléculaire, la microscopie, la biochimie et la structure des protéines en collaboration avec le laboratoire de W.D. Heyer (University of California, Davis, USA), pour comprendre la fonction des régulateurs de la formation des filaments Rad51. La description de l’organisation de ces protéines avec les filaments Rad51 nous permettra de développer de nouvelles approches thérapeutiques.
MÉTHYLATION DE L'ADN ET ORGANISATION 3D DU GÉNOME BACTÉRIEN
La méthylation de l'ADN chez les bactéries a été traditionnellement étudiée dans le contexte de la défense antiparasitaire. Cependant, les progrès du séquençage qui permettent l'analyse de la méthylation de l'ADN à l'échelle génomique se développent actuellement et ont propulsé une révolution épigénomique dans notre compréhension de l'étendue et de la pertinence physiologique de la méthylation. Généralement, la première étape de l'étude des impacts fonctionnels de la méthylation de l'ADN bactérien consiste à comparer l'expression globale des gènes entre des souches de type sauvage (WT) et des souches mutantes de méthyltransférase (MTase). Plusieurs études utilisant l'ARN-seq pour de telles comparaisons ont montré que la perturbation d'une seule MTase d'ADN entraîne souvent des dizaines, des centaines et parfois des milliers de gènes différentiellement exprimés (DE). Selon le modèle de compétition locale, la liaison compétitive entre une MTase et d'autres protéines liant l'ADN (par exemple, des facteurs de transcription) sur des sites de motifs spécifiques, affecte la transcription d'un gène voisin, entraînant une variation phénotypique au sein de la population bactérienne. Toutefois, si dans certains cas les effets régulateurs des MTases peuvent être attribués de manière concluante à la méthylation au niveau des promoteurs des gènes cibles, la grande majorité (>90%) des gènes DE n'ont pas de sites méthylés dans leurs régions promotrices, ce qui implique que les MTases ne sont pas des agents de régulation de la transcription, et que le modèle de compétition locale ne s'applique pas à la plupart des gènes DE. Une autre possibilité est que l'état de méthylation des motifs individuels régule l'expression d'un facteur de transcription, provoquant un large changement en aval dans l'expression de ses gènes cibles. Cependant, cette dernière hypothèse n'est pas suffisamment explicative pour un si grand nombre de gènes DE. Une hypothèse alternative concerne l'effet de la méthylation de l'ADN sur la topologie des chromosomes, en induisant des changements structurels qui modifient le répertoire des gènes exposés à la machinerie transcriptionnelle cellulaire. Nous avons récemment identifié CamA, une MTase core de Clostridioides difficile méthylant CAAAAA, qui joue un rôle dans la formation du biofilm, la sporulation et la transmission in vivo. De plus, dans une analyse ultérieure à grande échelle, nous avons découvert que CamA n'était que la partie émergée de l'iceberg, avec 45 % des espèces bactériennes de Genbank contenant au moins une MTase core ou quasi core, ce qui montre que ces dernières sont abondantes et suggère que leurs modifications épigénétiques sont également importantes pour les bactéries. En outre, des analogues de la S-adénosyl-l-méthionine (SAM) ont réussi à inhiber CamA, ce qui représente une première étape importante dans la création de thérapeutiques puissantes et sélectives ciblées sur l'épigénétique qui peuvent être exploitées comme nouveaux antimicrobiens.
Dans cette proposition de projet de doctorat, le candidat retenu est invité à déchiffrer l'interaction entre la méthylation bactérienne, l'organisation spatiale du génome et l'expression des gènes en répondant aux questions suivantes : i) la méthylation modifie-t-elle les domaines d'interaction chromosomique ? ii) les gènes DE et/ou les motifs de méthylation cibles sont-ils enrichis dans les limites des domaines d'interaction chromosomique modifiables ? iii) pouvons-nous modifier le méthylome (globalement ou localement) pour réprimer certains agents pathogènes humains ? Il / elle utilisera les technologies de séquençage Hi-C et long-read combinées à la génétique microbienne et à la génomique comparative pour faire progresser notre compréhension dans le domaine de l'épigénomique microbienne.
Etude des liens entre dérégulations du métabolisme et des marques épigénétiques dans la maladie de Huntington
Notre objectif est d’étudier les dérégulations épigénétiques dans la maladie de Huntington (HD). A l’aide de modèles souris, nous appréhenderons les liens entre altérations du métabolisme énergétique et défauts épigénétiques dans les neurones striataux, afin de mieux comprendre le mécanisme de vulnérabilité striatale dans la HD et de définir un nouveau cadre pour le développement de thérapies. Nous voulons obtenir des cartes détaillées des modifications post-traductionnelles (PTMs) des histones, en particulier des méthylations, de l'acétylation et de la lactylation récemment décrite. En effet, ces PTMs sont étroitement régulées par l'état métabolique des cellules. Nous utiliserons la protéomique qui est l'approche la mieux adaptée pour identifier et quantifier les multiples PTMs des protéines. Nous envisageons de travailler sur le striatum de souris WT, transgéniques R6/1 et du modèle plus progressif Q140 knock-in à différents stades de la maladie, afin de suivre l'évolution des PTMs d'histones et du métabolisme lors du vieillissement. En outre, pour obtenir une vision dynamique des liens entre les déséquilibres métaboliques et épigénétiques dans la maladie, nous injecterons du 13C-glucose par voie intrapéritonéale à des souris HD et contrôles, et nous analyserons l'incorporation du 13C dans les PTMs d'histones en fonction du temps. Enfin, il a été démontré que l'acétyl-CoA, le précurseur de l'acétylation des lysines des histones, est produit localement dans le noyau, par l'acétyl-CoA synthétase 2 (ACSS2), l'ATP-citrate lyase (ACLY) ou le complexe pyruvate déshydrogénase. Où et par quelles enzymes le lactate est produit reste une question ouverte. L'ACSS2 est un très bon candidat, car elle peut catalyser la production de molécules d'acyl-CoA à partir des acides gras correspondants. Pour appréhender la possible production de métabolites à proximité de la chromatine dans les cellules striatales, nous obtiendrons les distributions génomiques d'ACSS2 et d'ACLY par ChIPseq/CUT&tag et les comparerons aux distributions de marques d'histones acétylées et lactylées.
RMN du Xénon hyperpolarisé pour sonder la fonctionnalité de barrières biologiques
Le pompage optique du xénon, permettant d’obtenir rapidement un signal RMN intense, est une spécialité de l’équipe LSDRM. Le xénon, soluble dans les milieux biologiques, présente une grande gamme de déplacements chimiques, ce nous utilisons ici pour étudier les propriétés de barrières cellulaires. De nombreuses pathologies découlent d'une altération de celles-ci.
Dans ce sujet de thèse nous souhaitons développer une méthodologie spécifique au xénon hyperpolarisé pour étudier la fonctionnalité (intégrité, perméabilité, sélectivité) de barrières biologiques, en spectroscopie et en imagerie in vitro et in vivo. La thèse se déroulera en deux parties : in vitro il s’agira de développer un dispositif et les protocoles RMN permettant d’étudier des assemblages cellulaires modèles; in vivo des études sur rongeurs permettront d’évaluer l’aptitude du xénon à atteindre des organes plus ou moins proches des poumons en gardant sa polarisation, et de mesurer des cinétiques de passage. Ce sujet permettra des avancées instrumentales et méthodologiques majeures, ainsi qu’un approfondissement des connaissances sur les processus de transports sélectifs au niveau de différentes barrières biologiques.
Condensats et Chromatine : Comment la Séparation de Phase Façonne les Réponses des Plantes à la Température
Les plantes doivent adapter leur développement aux conditions environnementales, notamment à l'augmentation des températures due au changement climatique. Le stress thermique impacte significativement la physiologie des plantes, et pour atténuer ces effets, elles ont développé des réponses au choc thermique (HSR), avec le facteur de choc thermique A1a (HSFA1a) jouant le rôle de régulateur principal chez Arabidopsis thaliana. En l'absence de stress, HSFA1a reste cytosolique et inactif, lié aux protéines de choc thermique (HSPs). Le stress thermique provoque la dissociation des HSPs, permettant la translocation nucléaire, la trimérisation, la liaison à la chromatine et l'activation des gènes de réponse au stress. Des études récentes révèlent qu'HSFA1a pourrait agir comme un facteur de transcription pionnier pour accéder à des régions chromatiniennes fermées et initier la HSR. De plus, des résultats préliminaires suggèrent qu'HSFA1a subit une séparation de phase liquide-liquide (LLPS) pour former des condensats nucléaires régulant l'expression des gènes. Ce projet vise à 1) explorer l'effet de la température sur la structure et l'oligomérisation de HSFA1a, 2) étudier la LLPS de HSFA1a en présence et en absence d'ADN, 3) caractériser l'activité pionnière de HSFA1a, et 4) déterminer l'importance physiologique de la LLPS dans la HSR.
Caractérisation du mécanisme moléculaire de détection des terres rares chez Pseudomonas putida et développement de biosenseurs associés.
Les terres rares (TR) sont des métaux largement utilisés dans les hautes technologies et la demande en TR devrait doubler d’ici 30 ans. L’extraction sélective et le recyclage des TR ont un triple enjeu, économique, technologique et écologique. Actuellement, moins de 1% des TR sont recyclées. De plus, les méthodes d’extraction sont fastidieuses et polluantes. Elles nécessitent plusieurs étapes avec acides ou solvants. La découverte en 2011 d’enzymes utilisant naturellement les TR légères a ouvert de nouvelles perspectives. Le développement de méthodes biosourcées pourrait être un élément clé pour débloquer les verrous de sélectivité et d’extraction actuels. Cette thèse s’inscrit dans la thématique biotechnologies de demain. Le but de cette thèse, est d’acquérir des données fondamentales sur le mécanisme moléculaire d’un système biologique de perception sélective des TR afin d’en tirer profit pour le développement d’un crible basé sur des biosenseurs répondant spécifiquement à certaines d’entre elles. Des techniques de biologie cellulaire, biochimie et d’analyse in silico avec des outils d’intelligence artificielle seront utilisées pour accomplir ce projet. Les résultats obtenus permettront d’identifier : 1) le mécanisme moléculaire de détection des TR et les facteurs influençant sa sélectivité, 2) les sites de liaison du régulateur et les gènes impliqués dans cette réponse, et 3) le développement à partir de 1) and 2) de biosenseurs robustes et sélectifs.
Nouvel outil de diagnostic rapide pour la septicémie : biopuce microfluidique pour la détection multicible par amplification isotherme
Le sepsis est l’une des principales causes de mortalité dans le monde qui résulte généralement d’une infection bactérienne mais peut être aussi causé par des virus, des champignons ou des parasites. Un diagnostic rapide est essentiel pour une prise en charge efficace et augmenter les chances de survie du patient. Il existe des solutions commerciales de détection d’acides nucléiques par qPCR capable de détecter plusieurs cibles. Cependant ces techniques sont limitées par le nombre de canaux de fluorescence disponible sur l’instrument ou par le nombre de chambre de lecture. Ces techniques d’amorces LAMP (amplification isotherme en temps réel) spécifiques sur un support solide tel que le COC ou le verre.
Les résultats attendus sont l’élaboration d’une biopuce permettant de détecter en temps réel et en quelques minutes fragmentent l’échantillon pour pouvoir être multiplexe, ce qui conduit à une perte de sensibilité.
Pour répondre à la question : comment détecter plusieurs cibles sans perdre en sensibilité ? Le doctorant devra réaliser dans une unique chambre réactionnelle, une détection multiplexe par régionalisation plusieurs ADN cibles, comprenant : le design et le choix des amorces, l’immobilisation des amorces par fonctionnalisation de surface, l’intégration en carte micro fluidique et le traitement des données pour la détection par fluorescence de sondes spécifiques des cibles.
Cette innovation technologique, permettra au doctorant d’acquérir de solides compétences dans divers domaines tels que la biologie moléculaire, la fonctionnalisation de surface, la modélisation et la simulation tout en s’inscrivant dans une équipe pluridisciplinaire.
Dialogue entre les adipocytes et les lymphocytes T, acteurs clés de l’immunité dans le tissu adipeux
Le rôle métabolique et endocrine du tissu adipeux (TA) est établi. Le TA est composé majoritairement d’adipocytes mais aussi de cellules immunitaires, surtout connues pour contrôler l’homéostasie métabolique du tissu. L’activité immunitaire du TA est associée à la sécrétion de cytokines et de métabolites qui modulent la fonction immune. L’obésité, caractérisée par une accumulation de TA au niveau sous-cutané ou viscéral, est associée à une inflammation locale du TA. Pourtant, le TA peut être infecté par différents pathogènes et il constitue un site d’accumulation de lymphocytes T (LT) CD8 spécifiques de ceux-ci, qui protègent contre une réinfection. Ces données incitent donc à préciser lors d’une infection les interactions entre adipocytes et LT-CD8 du TA.
Le projet sera réalisé dans l’équipe CoVir qui développe divers projets visant à décrypter les propriétés anti-infectieuses du tissu adipeux. Il s’inscrit dans le cadre d’un consortium établi pour un projet ANR (INSERM, CNRS, Institut Pasteur de Lille). L’objectif du projet de l’équipe est d’étudier la contribution locale des adipocytes et des LT-CD8 résidants dans le TA au cours de l’infection par le virus de la grippe dans un modèle de primate non-humain (PNH). Le PNH présente des réponses métaboliques et immunitaire proches de l’homme. En complément des approches in-vivo chez le PNH, nous allons développer un modèle 3D de co-culture pour cibler l’interaction entre adipocytes et LT-CD8, sans interférence des signaux inflammatoires, métaboliques extérieurs au TA. Ce projet bénéficie de l’expertise historique développée dans l’institut (IMVA-HB UMR 1184/I IDMIT, dirigée par R. Le Grand) concernant l’étude des infections virales dans le modèle préclinique de PNH. Les plateformes de l’IDMIT mettent à disposition des équipements et une expertise en histologie, en cytométrie (LFC), de détection des cytokines/chimiokines (L2I) et pour le bien-être animal (ASW).
Le projet de thèse se concentrera sur les approches in vitro. Nous comparerons les interactions entre adipocytes et les LT, en étudiant la réponse métabolique et immunitaire de chacune de ces fractions. En effet, les cellules adipocytaires présentent une activité métabolique forte mais exercent une activité immunitaire propre (par la production de peptides microbicides) et une activité immuno-modulatrice. Concernant les cellules immunitaires, leur activité fonctionnelle est dépendante de leurs fonctions métaboliques et il est crucial d’évaluer les modifications immuno-métaboliques des cellules immunitaires en présence d’’adipocytes. Le modèle organoïde nous permettra d’évaluer : (i) l’impact du contexte d’obésité à celles dans un contexte de normalité métabolique, (ii) l’impact de pathogènes viraux sur chacune de ces deux fractions. A moyen terme, ce modèle permettra de tester des stratégies de modulation des fonctions du TA au cours des pathologies métaboliques ou des infections virales.
Vers une compréhension fine de la régulation de l’expression des gènes par l’acétylation et la lactylation des protéines histones
Dans les cellules eucaryotes, l’ADN s’enroule autour de protéines histones pour former la chromatine. La modification dynamique des histones par diverses structures chimiques permet de réguler finement l’expression des gènes. Des altérations dans ces mécanismes complexes de régulation sont à l’origine de nombreuses maladies. L’acétylation des lysines d’histones est connue pour induire l’expression des gènes. D’autres structures peuvent être ajoutées sur les histones, dont les effets sur la transcription restent largement à élucider. La plupart d’entre elles, comme la lactylation découverte en 2019, dépendent du métabolisme cellulaire. Nous avons commencé l’étude de la lactylation dans la spermatogenèse murine. Ce processus de différentiation cellulaire constitue en effet un modèle de choix pour étudier la régulation de la transcription, du fait de changements spectaculaires dans la composition de la chromatine et dans le programme d’expression génique. Nous avons généré de nouveaux profils épigénétiques consistant en la distribution sur le génome de marques acétylées et lactylées sur trois lysines de l’histone H3. L’objet de cette thèse est de contribuer au déchiffrage du « code histone », d’abord en étudiant le rôle des lactylations sur le programme transcriptionnel. Ensuite, la prédiction d'états chromatiniens sera raffinée en intégrant au sein de modèles de réseaux de neurones nos nouvelles données à l'ensemble des données épigénomiques existant aux deux stades cellulaires étudiés.