Les protéines fluorescentes, et en particulier les protéines fluorescentes réversiblement commutables (RSFPs), ont révolutionné l’imagerie par fluorescence avancée, ouvrant la voie à des applications comme la microscopie à super-résolution. Parmi les alternatives émergentes, les rapporteurs basés sur des fluorogènes, tels que les systèmes FAST (Fluorescence Activating and Absorption Shifting Tag) se distinguent par leur grande photostabilité et leur polyvalence. FAST fonctionne par liaison non covalente d’une petite protéine modifiée à un fluorogène organique, ce qui induit la fluorescence et permet un suivi en temps réel sans maturation du chromophore. Cependant, des défis subsistent dans l’optimisation de ces systèmes en raison d’une compréhension limitée des interactions fluorogène-protéine, des dynamiques de liaison et des comportements photophysiques sous illumination. Ce projet de thèse vise à caractériser les modes de liaison des systèmes FAST à une résolution atomique à l'aide de la spectroscopie RMN multidimensionnelle, de la cristallographie aux rayons X et de la spectroscopie UV-visible. Des résultats récents suggèrent que les fluorogènes peuvent adopter plusieurs modes de liaison et que de légères modifications chimiques affectent les cinétiques de liaison et l’intensité de la fluorescence. En intégrant un dispositif d'illumination laser dans les investigations RMN, nous explorerons plus avant comment l'absorption lumineuse influence la conformation et la dynamique des fluorogènes. Les connaissances ainsi acquises permettront de concevoir de manière rationnelle des variants optimisés de FAST, améliorant leurs performances pour des applications spécifiques en microscopie et faisant progresser le domaine de l’imagerie par fluorescence.